做完轉錄組分析之后，一般都要求做qRT-PCR來驗證二代測序得到的轉錄本表達是否可靠。熒光定量PCR是一種相對表達定量的方法，他的計算方法有很多，常用的相對定量數(shù)據(jù)分析方法有雙標曲線法，ΔCt法，2^-ΔΔCt法(Livak法)，用參照基因的ΔCt法和Pfaffl法。這里主要講解常用的2^-ΔΔCt法(Livak法)如何計算；

qRT-PCR原理：

以基因的cDNA為模板進行PCR擴增，在PCR擴增過程中，通過收集熒光信號，對PCR進程進行實時檢測。由于在PCR擴增的指數(shù)時期，模板的Ct 值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關系，所以可以定量。

Ct值是什么意思呢？

Ct 值的含義是：每個反應管內的熒光信號達到設定的域值時所經歷的循環(huán)數(shù) (cycle)。 qRT-PCR在擴增的時候都會有平臺期，在平臺期之前，PCR 擴增就是簡單的指數(shù)增長，也就是 1 變 2，2 變 4，4 變 8 …擴增。數(shù)學形式就是 2 的 ct 次方，到了平臺期所有基因擴增的數(shù)目是一致的，而唯一有區(qū)別的則是 ct 值的不同。所以不難推斷出 ct 值越小，反應擴增到達平臺期所需循環(huán)數(shù)越少，目的基因起始含量越高。這里可以得到公式：

計算-ΔΔCt

在這里，我們有一個對照組，一個處理組，還有一個內參基因和目的基因，想看一下目的基因在處理組中相對與對照中的表達差異，也就是計算-ΔΔCt：數(shù)據(jù)如下：

1.計算每組內參基因sgAction Ct均值

計算第一個 Δct，即每組的待檢目的基因減去內參基因的 Ct 值

3.計算對照CK組中 Δct 的均值，再用處理組的 每一個Δct 減去剛剛計算的對照CK組的 Δct 均值，得到 ΔΔct（紅框框）

4.相對表達量計算，也就是相對于對照組: 2^-ΔΔct：

不難看出這里的-ΔΔct和我們轉錄組當中的log2（fold change）值是一致的，所以如果多做幾個基因就可以繪制類似如下圖：

或者相關性點圖：

測試數(shù)據(jù)表格下載：qRT-PCR_demo_data.xlsx

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