摘要：目的 運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接探究白芍-麥冬藥對治療干燥綜合征（sj?gren syndrome，SS）的作用機制。方法 通過BATMAN、Gene Cards、OMIM、Drug Bank、TTD、DISGENET數(shù)據(jù)庫和Cytoscape軟件發(fā)現(xiàn)并探究相關(guān)治療靶點作用關(guān)系。通過String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。通過DAVID平臺進行GO與KEGG富集分析。使用AutoDock Tools1.5.7軟件進行分子對接。結(jié)果 白芍-麥冬有57個有效活性成分，362個作用靶點，SS有1219個疾病相關(guān)靶點。主要有效成分為豆甾醇、沒食子酸、β-谷甾醇，核心靶點AKT1、IL1B、CAT、IGF1。GO分析中，GO生物過程（biological process，BP）主要包括基因表達的負調(diào)控、脂多糖的反應(yīng)、RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)節(jié)等；GO細胞組分（cellular components，CC）主要包括細胞表面、細胞外區(qū)域、細胞外體等；GO分子功能（molecular function，MF）主要包括血紅素結(jié)合、類固醇結(jié)合、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子活性等。KEGG富集分析中主要包括MAPK信號通路、TNF信號通路、cAMP信號傳導(dǎo)途徑等；分子對接實驗表明其主要活性成分與核心靶點之間存在良好的結(jié)合活性。結(jié)論 白芍-麥冬藥對通過多靶點、多通路發(fā)揮治療SS的作用。

關(guān)鍵詞：網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；分子對接；白芍-麥冬；干燥綜合征

干燥綜合征（sj?gren syndrome，SS）是一種以唾液腺、淚腺等分泌腺受累為主要特征的自體免疫疾病，臨床上以眼干、口干等為主要特征。目前SS具體發(fā)病機制尚未十分明確，但有研究表明其病因與免疫、遺傳、環(huán)境、性激素水平、細胞免疫、體液免疫等多種因素的交互作用有關(guān)，過度的炎癥反應(yīng)和免疫損傷是導(dǎo)致SS的重要原因。中國人群中SS的患病率為0.29%～0.77%，好發(fā)年齡為30～60歲，女性多見，男女比為1∶9～1∶10。目前西藥治療SS只能改善癥狀、延緩疾病的和發(fā)展，并不能根治。除此之外西藥在治療SS的過程中不良反應(yīng)、副作用較多。劉健教授研究發(fā)現(xiàn)臨床上常用白芍、麥冬治療SS，且有良好的治療效果。本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，探討白芍-麥冬在SS的治療機理上的獨特優(yōu)勢，并運用分子對接對其進行驗證，為白芍-麥冬藥物治療SS提供了新的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 白芍-麥冬藥對成分的獲取及相關(guān)靶點篩選 在BATMAN數(shù)據(jù)庫中分別輸入“baishao”、“maidong”，以參數(shù)分數(shù)大于20（Scorecutoff>20）且P值<0.05（AdjustedP-value<0.05）作為篩選指標，篩選出白芍、麥冬的有效成分和作用靶點。

1.2 SS相關(guān)靶點篩選及白芍-麥冬治療SS的潛在作用靶點的獲取 以“Sj?gren syndrome”為關(guān)鍵詞，分別在GeneCards（http：//www.genecards.org/）、TTD數(shù)據(jù)（http：//db.idrblab.net/ttd/）、OMIM數(shù)據(jù)庫（http：//www.omim.org/）、DISGENET數(shù)據(jù)庫（http：//www.disgenet.org/）、DrugBank數(shù)據(jù)（http：//www.drugbank.ca/）中檢索，獲得疾病相關(guān)靶點。運用venny 2.1.0在線繪制韋恩圖，得到白芍-麥冬治療SS的潛在作用靶點。

1.3 構(gòu)建白芍-麥冬有效成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)圖 將1.1和1.2中所獲得數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.9.1軟件中，構(gòu)建白芍-麥冬有效成分-作用靶點的網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建白芍-麥冬藥對治療SS的核心靶點篩選 將藥物靶點與疾病靶點取交集，篩選出“白芍-麥冬”藥對治療SS的相關(guān)靶點，并在STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）中構(gòu)建蛋白——蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，物種選擇“Homo sapiens”，等值置信度為0.4，其余參數(shù)設(shè)置為默認值，保存結(jié)果中的csv.文件。用Cytoscape3.9.1軟件構(gòu)建可視化網(wǎng)絡(luò)，并通過軟件中的CytoNCA插件進行網(wǎng)絡(luò)拓撲分析，篩選出核心靶點。

1.5 GO和KEGG通路富集分析 在DAVID數(shù)據(jù)庫中，將物種設(shè)置為“Homo Sapiens”，對其共同靶點進行GO和KEGG富集分析。在GO富集分析中獲得生物過程（Biological Processes，BP），分子功能（Molecular Functions，MF），細胞成分（Cellular Components，CC）的分析結(jié)果，并篩選P值最小的前10個結(jié)果進行研究。在KEGG富集分析結(jié)果中篩選P值最小的前20個通路，通過微生信平臺（http：//www.bioinformatics.com.cn/）進行可視化處理。

1.6 分子對接驗證 篩選出來的疾病關(guān)鍵靶點和藥物主要活性成分分別作為受體蛋白和配體小分子。在PDB數(shù)據(jù)庫（http：//www1.rcsb.org/）中獲取受體蛋白的3D結(jié)構(gòu)并下載其pdb格式文件，從UniProt（https：//www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫下載配體小分子的sdf格式文件，并在Open Babel軟件中將小分子的sdf格式轉(zhuǎn)化成pdb格式作為分子對接的配體。使用AutoDock Tools 1.5.7對配體和受體進行分子對接，并使用Pymol將分子對接結(jié)果進行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 “白芍-麥冬”藥對有效成分及相關(guān)靶點的獲取 在BATMAN數(shù)據(jù)庫中篩選后得到白芍35個有效成分，300個作用靶點，刪除重復(fù)項后得到144個作用靶點；麥冬22個有效成分，305個作用靶點，刪除重復(fù)項得到243個作用靶點。兩種藥物共有387個作用靶點，刪除重復(fù)項后得到362個作用靶點。

2.2 SS相關(guān)靶點的篩選及白芍-麥冬治療SS的潛在作用靶點的獲取 在Gene Cards數(shù)據(jù)庫中檢索得到968個疾病靶點；在TTD數(shù)據(jù)庫中中檢索得到10個疾病靶點；在OMIM數(shù)據(jù)庫中檢索得到654個疾病靶點；在Drug Bank數(shù)據(jù)庫中檢索得到41個疾病靶點；在DISGENET數(shù)據(jù)庫中檢索得到482個疾病靶點，五個數(shù)據(jù)庫共獲得靶點1565個疾病靶點，篩除重復(fù)靶點后最終獲得1219個疾病靶點。運用venny 2.1.0在線繪制韋恩圖，得到白芍-麥冬治療SS的潛在作用靶點（見圖1）。

2.3 中藥有效成分-作用靶點互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過Cytoscape3.9.1軟件構(gòu)建“白芍-麥冬”藥對的“有效成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。然后使用工具Network Analyzer進行分析，根據(jù)等級值（Degree）設(shè)置節(jié)點大小和顏色深淺。該網(wǎng)絡(luò)中共有94個節(jié)點，149條邊（圖1），其中紅色表示白芍、麥冬兩味藥物、黃色表示麥冬的成分、綠色表示白芍的成分、藍色表示基因（見圖2）。等級排名前3的有效活性成分分別是：分別豆甾醇、沒食子酸、β-谷甾醇（見表1）。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及核心靶點篩選 將“白芍-麥冬-SS”三者共同靶點基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫中進行分析處理，然后將從 STRING數(shù)據(jù)庫中獲取的 csv文件導(dǎo)入Cytoscape3.9.1中進行分析，最終得到一個有62個節(jié)點，251條邊的核心靶點圖。根據(jù)Degree值進行分層排列得到最終的4個核心靶點。分別是：AKT1、IL1B、CAT、IGF1。圖中靶點的Degree值越大，節(jié)點越大，顏色越深、各靶點間的連線越粗，越能表明這4個核心靶點可能成為治療SS的關(guān)鍵靶點，見圖3。

2.5 GO和KEGG通路富集分析 通過DAVID數(shù)據(jù)庫，計算富集得到富集分析結(jié)果。通過微生信平臺繪制GO和KEGG分析圖（見圖4、圖5）。從GO分析圖來看白芍-麥冬有效活性成分作用的靶點主要富集在分子功能（BP）的基因表達的負調(diào)控、RNA聚合酶II啟動子的轉(zhuǎn)錄的負向調(diào)節(jié)、RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)節(jié)、DNA誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄等生物過程；在細胞組成（CC）方面，細胞外區(qū)域、細胞外秘體、細胞質(zhì)、核質(zhì)體占比較高；在分子功能（MF）方面，血紅素結(jié)合、酶結(jié)合、鐵離子結(jié)合、氧化還原酶的活性排在前列。從KEGG分析中圖可以看出，“白芍-麥冬”藥對治療SS主要參與的信號通路包括代謝途徑、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、MAPK信號通路、TNF信號通路、cAMP信號傳導(dǎo)途徑等。

2.6 分子對接驗證 將PPI網(wǎng)絡(luò)圖中篩選出來的核心靶點取前3位AKT1、IL1B、CAT做為受體分別于與“白芍-麥冬有效成分-疾病靶點”圖中Degree值排名前3的成分豆甾醇、沒食子酸、β-谷甾醇進行分子對接，計算出受體與配體之間的結(jié)合能，對接結(jié)果見表2。根據(jù)對接結(jié)果運用Rstudio軟件繪制熱能圖（見圖6）。通常認為結(jié)合能越低，受體和配體之間的結(jié)合力越強、穩(wěn)定性越高。根據(jù)對接結(jié)果用PymoL軟件對其部分分子對接結(jié)果進行可視化處理（見圖7）。

3 討論

在中醫(yī)典籍中尚未找到與 SS 相對應(yīng)的確切病名，由于其病因病機復(fù)雜，臨床表現(xiàn)多種多樣，因此歷代醫(yī)家將其歸入“燥證”、“虛勞”、“周痹”等范疇?！霸锉浴笔?0年代路志正教授提出的一種病癥，路老認為，其主要病機是陰血虧虛，津枯液干，故以益氣養(yǎng)陰、潤燥生津為主。劉健教授根據(jù)多年對SS患者臨床癥狀的觀察，認為該病以脾胃虧虛，氣陰兩虛為本，故治療上以益氣健脾，養(yǎng)陰生津為主。白芍味苦、酸，性微寒，歸肝、脾經(jīng)，具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗、柔肝止痛、平抑肝陽等作用?，F(xiàn)代藥理研究顯示，白芍具有鎮(zhèn)痛、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等作用。麥冬 味甘、微苦，性微寒，歸肺、胃、心經(jīng)具有養(yǎng)陰潤肺、益胃生津、清心除煩之功效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)其具有抗炎、抗氧化、保護心血管系統(tǒng)以及免疫調(diào)節(jié)等作用。本次研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的角度探究白芍-麥冬藥對治療SS的作用機制。

從PPI網(wǎng)絡(luò)圖分析可知，“白芍-麥冬”藥對的活性成分靶點與SS疾病靶點有67個共同靶位基因，主要包括AKT1、IL1B、CAT、IGF1、MPO、EDN1、NOS1等。

在Cytoscape數(shù)據(jù)庫中運用軟件中的CytoNCA插件篩選出4個關(guān)鍵基因，分別是AKT1、IL1B、CAT、IGF1，表示它們可能是“白芍-麥冬”藥對治療SS的關(guān)鍵靶點。AKT是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶一種，AKT1是其3個關(guān)系密切的家庭成員之一，主要參與調(diào)控細胞代謝、炎癥反應(yīng)、血管生成等生物過程。CAT（過氧化氫酶）是一種以鐵卟啉為輔基的結(jié)合酶，具有抑制炎癥反應(yīng)、激活免疫途徑、增強機體免疫力等生理功能。研究發(fā)現(xiàn)，CAT可以減弱NF-κB的活化程度，下調(diào)與免疫相關(guān)的細胞因子，進而減少炎性因子的表達，緩解炎性反應(yīng)。IL-1β在SS患者中高表達，通過與膜受體結(jié)合后激活核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信號通路，促進TNF-α、IL-1β以及IL-8等一系列促炎因子的表達，從而使炎性反應(yīng)持續(xù)加重。IGF1是一種活性蛋白多肽物質(zhì)，研究表明IGF1刺激促炎因子TNF-α、IL-6的產(chǎn)生，并通過MAPK信號通路增強人外周血單核細胞的促炎反應(yīng)。從PPI網(wǎng)絡(luò)圖中可以看出這些靶點具有協(xié)同效應(yīng)，并可通過抑制炎癥遞質(zhì)水平、調(diào)節(jié)免疫等途徑實現(xiàn)對 SS的治療。

從KEGG通路富集分析圖可知，“白芍-麥冬”藥對可能通過MAPK信號通路、TNF信號通路、cAMP信號傳導(dǎo)途徑等參與RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄、炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)等作用治療SS。MAPK信號通路通過調(diào)控TNF-α，IL-1β和IL-6等促炎因子的表達水平，從而調(diào)節(jié)抗感染機制的平衡，參與炎癥反應(yīng)。研究表明MAPK信號通路不僅在炎癥反應(yīng)中起作用，而且在 T細胞、B細胞、樹突狀細胞等免疫細胞中也起著調(diào)控作用。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)TNF-α在SS患者的血清及唇腺組織中表達顯著增加，表明TNF-α參與了SS疾病發(fā)展過程。從“有效成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖分析可知，“白芍-麥冬”藥對中核心成分主要3種，分別豆甾醇、沒食子酸、β-谷甾。麥冬中的豆甾醇不僅能有效抑制炎癥因子IL-1β和TNF-α的水平，而且還能升高抗炎因子IL-10水平，發(fā)揮抗炎作用。沒食子酸是一種天然多酚類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒的作用。β-谷甾醇能抑制 LPS誘發(fā)的表皮細胞和巨噬細胞的炎癥小體NLRP3，從而抑制 MAPK信號途徑的激活，降低 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等炎癥因子的分泌，從而達到抗炎的效果。67個靶點基因可能通過與MAPK信號通路、TNF信號通路、cAMP信號傳導(dǎo)途徑等信號通路作用在其核心靶點發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫等作用。

綜上所述，本文以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為基礎(chǔ)，探討了白芍-麥冬的有效成分、作用靶點、蛋白關(guān)系網(wǎng)絡(luò)、KEGG通路的富集分析。表明白芍-麥冬治療SS是多種成分通過多條通路作用于多個靶點的結(jié)果。分子對接的結(jié)果表明，核心成分與核心靶點結(jié)合良好。并由此推測“白芍-麥冬”藥對可能通過豆甾醇、沒食子酸、β-谷甾醇等有效活性成分調(diào)控AKT1、IL1B、CAT、IGF1、MPO、EDN1、NOS1等67個疾病靶點，影響炎癥應(yīng)答、免疫調(diào)節(jié)的負調(diào)控等相關(guān)生物學(xué)過程及MAPK信號通路、TNF信號通路、cAMP信號傳導(dǎo)途徑等從而發(fā)揮治療SS的作用，為后續(xù)深入研究“白芍-麥冬”治療SS提供了理論依據(jù)，為“白芍-麥冬”藥物的研發(fā)提供新思路，但其結(jié)論有待于更有針對性的細胞實驗、動物試驗等方法來證實，以更好地闡明其臨床機理。

參考文獻：

［1］Vartoukian SR，Tilakaratne W M，Seoudl N，et al. Dysregulation of the suppressor of cytokine signalling 3-signal transducer and activator of transcription-3 pathway in the aetiopathogenesis of Sj?gren’s syndrome［J］.Clin Exp Immunol，2014，177（3）：618-629.

［2］Yao W，Le Q.Social-economic analysis of patients with Sj?gren’s syndrome dry eye in East China：across-sectional study［J］.BMC Ophthalmol，2018，18（1）：23.

［3］阿古達木，陳薇薇，夏嘉，等.蘇曉從三焦辨治干燥綜合征的經(jīng)驗［J］.上海中醫(yī)藥雜志，2021，55（5）：27-29.

［4］陳瑞蓮，劉健，汪元，等.劉健教授中醫(yī)藥治療干燥綜合征用藥規(guī)律的數(shù)據(jù)挖掘研究［J］.風(fēng)濕病與關(guān)節(jié)炎，2021，10（6）：1-5+28.

［5］姜泉，張華東，陳祎，等.路志正治療干燥綜合征經(jīng)驗［J］.中醫(yī)雜志，2016，57（6）：463-465

第一作者

羅鴻 中國清華大學(xué)生命學(xué)院生物專業(yè)創(chuàng)新領(lǐng)軍工程博士研究生預(yù)科、中國國家藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院2023級碩士研究生、中國信息協(xié)會大數(shù)據(jù)分會大數(shù)據(jù)與生物項目特約顧問。

張穎? ? 中國清華大學(xué)生命學(xué)院生物專業(yè)創(chuàng)新領(lǐng)軍工程博士研究生預(yù)科、中國國家藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院2023級碩士研究生。