當(dāng)單個(gè)細(xì)胞在體外增殖6代以上，其后代所組成的細(xì)胞群體，成為集落或克隆。每個(gè)克隆含有50以上的細(xì)胞，大小在0 .3-1.0mm之間?？寺⌒纬墒菧y(cè)定細(xì)胞增殖能力的有效方法之一?？寺⌒纬陕史从臣?xì)胞兩個(gè)重要性狀：細(xì)胞群體依賴性、增殖能力。

由于細(xì)胞生物學(xué)性狀不同，細(xì)胞克隆形成率差別也很大，一般來(lái)說(shuō)：

初代培養(yǎng)細(xì)胞克隆形成率弱，傳代細(xì)胞系強(qiáng)；

二倍體細(xì)胞克隆形成率弱，轉(zhuǎn)化細(xì)胞系強(qiáng)；

正常細(xì)胞克隆形成率弱，腫瘤細(xì)胞強(qiáng)；

成纖維細(xì)胞克隆形成能力弱，上皮細(xì)胞形成能力強(qiáng)。

檢測(cè)克隆形成率：平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

一、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

主要適用于貼壁細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)方法如下：

1、取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的單層培養(yǎng)細(xì)胞，用0.25% 胰蛋白酶消化并吹打成單個(gè)細(xì)胞，把細(xì)胞懸浮在完全培養(yǎng)基中備用。

2、將細(xì)胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋，以適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度(根據(jù)增殖能力)接種于培養(yǎng)皿中。一般分每孔50、100、200個(gè)細(xì)胞的梯度密度分別接種含六孔板中，必要時(shí)可設(shè)置2個(gè)平行，并用十字法混勻，使細(xì)胞分散均勻。置37℃，5% CO2及飽和濕度的環(huán)境下，靜置培養(yǎng)14天，培養(yǎng)7天時(shí)可換液。

3、14天后，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。加多聚甲醛固定30分鐘。然后去固定液，加適量結(jié)晶紫染色液染30分鐘，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。

4、將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，用肉眼直接計(jì)數(shù)克隆，或在顯微鏡(低倍鏡)計(jì)數(shù)大于10個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。最后計(jì)算克隆形成率?？寺⌒纬陕? (克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%。

二、軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)——懸浮細(xì)胞

主要適用于貼壁細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)方法如下：

1、雙蒸水配制10ml的1.2% Argrose和0.7% Argrose，高壓滅菌后，維持在42℃中不會(huì)凝固；

2、實(shí)驗(yàn)前，將水浴鍋放入超凈臺(tái)內(nèi)，紫外照射，設(shè)定溫度42℃。

3、如已制好上下膠，則在微波爐中溶解1.2% Argrose下膠和0.7% Argrose上膠，降溫后放入42℃水浴鍋中保持。

4、根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要的量配制20% FBS+2×基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

5、鋪下膠：按1:1比例使1.2% Argrose下膠和20%FBS+2×基礎(chǔ)培養(yǎng)基混合，6孔板每孔迅速加入1.5ml混合液，輕輕混勻，室溫靜置待下膠凝固（加混合液時(shí)不能產(chǎn)生氣泡）。對(duì)于一個(gè)6孔板，配5ml上述培養(yǎng)液+5ml 1.2% Argrose下膠于50ml離心管中（離心管要一直置于水浴鍋中）。

6、細(xì)胞計(jì)數(shù)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，輕輕吹打，使之成為單細(xì)胞，活細(xì)胞計(jì)數(shù)，用培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度至40×104／ml以上，這樣加的體積小于100ul，不會(huì)影響其他成分的稀釋程度。每孔鋪104個(gè)細(xì)胞。

7、鋪上膠：按1:1比例混合0.7% Argrose上膠和20%FBS+2×基礎(chǔ)培養(yǎng)基，一組細(xì)胞需先配2ml（20%FBS+2×基礎(chǔ)培養(yǎng)基）+2ml 0.7% Argrose上膠于離心管中混勻，放入42℃水浴鍋中保持。再將細(xì)胞懸液加入上述混合液中，混勻后迅速加入6孔板中，每孔1ml。待上層瓊脂凝固后，置于5%CO2，37℃，培養(yǎng)2-3 周。

8、間隔2天補(bǔ)加200ul 完全培養(yǎng)基，以防過(guò)于干燥。

9、計(jì)數(shù)克?。喊哑矫蠓胖迷诘怪蔑@微鏡下（100×），在鏡下隨機(jī)選擇10個(gè)視野，計(jì)數(shù)視野中大于50個(gè)克隆數(shù)(﹥0.05mm的克隆)和所有克隆數(shù)，克隆形成率=大于50個(gè)克隆數(shù)/所有克隆數(shù)×100%。每孔加入1ml的結(jié)晶紫染液，30min，鏡下拍照。

注意事項(xiàng)

1、接種時(shí)細(xì)胞密度適度，不可過(guò)高。

2、軟瓊脂與細(xì)胞混合時(shí)溫度不能超過(guò)40℃，否則將會(huì)燙傷/死細(xì)胞；

3、瓊脂對(duì)熱和酸不穩(wěn)定，若反復(fù)加熱，容易降解而產(chǎn)生毒性，且硬度下降。因此高壓滅菌后應(yīng)進(jìn)行分裝；

4、細(xì)胞在進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn)時(shí)要求有95%以上的分散度，否則結(jié)果的準(zhǔn)確度會(huì)受到很大影響；

5、細(xì)胞在低密度、非貼壁狀態(tài)條件下培養(yǎng)，生存率明顯下降，永生細(xì)胞系/株克隆形成率可達(dá)到10%以上，但初代培養(yǎng)細(xì)胞和有限傳代細(xì)胞系克隆形成率僅為0.5%-5%，甚至無(wú)法形成單個(gè)克隆。因此，為了提高克隆形成率，有時(shí)需要在培養(yǎng)基中添加胰島素、地塞米松等促克隆形成物質(zhì)。

6、細(xì)胞接種存活率只表示接種細(xì)胞后貼壁的細(xì)胞數(shù)，但貼壁后的細(xì)胞不一定每個(gè)都能增殖和形成克隆。做克隆形成率測(cè)定時(shí)，接種細(xì)胞一定要分散成單細(xì)胞懸液，直接接種在碟皿中，持續(xù)一周，隨時(shí)檢查，到細(xì)胞形成克隆時(shí)終止培養(yǎng)。

ClonePlus?技術(shù)

我們從傳統(tǒng)方法中不斷吸取經(jīng)驗(yàn)摒棄不足，Cas9X海星生物技術(shù)平臺(tái)研發(fā)出了ClonePlus?技術(shù)。使絕大部分細(xì)胞克隆形成率達(dá)到90%以上，個(gè)別克隆形成能力較差的細(xì)胞例HepG2通過(guò)ClonePlus?技術(shù)也能夠在短時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定篩選出單克隆，而且克隆形成的時(shí)間可縮短到1-2周的時(shí)間，大大壓縮了整個(gè)單克隆生長(zhǎng)的時(shí)間周期，贏得寶貴的時(shí)間。