編者按：本文是Illumina團隊出的NGS技術(shù)在單細(xì)胞研究中的應(yīng)用，坊間以pdf的形式傳閱，余以為多有不便，今摘抄于此。版權(quán)歸原作者所有，侵刪，內(nèi)容僅供學(xué)習(xí)，更多詳細(xì)信息請閱讀原文。由于是綜述文章，引用較多，這里為放方便閱讀見，從略。
單細(xì)胞研究|| 利用 Illumina?技術(shù)的近期單細(xì)胞研究文獻綜述（應(yīng)用篇一） 主要介紹單細(xì)胞技術(shù)在癌癥、宏基因組學(xué)、干細(xì)胞、發(fā)育生物學(xué)、免疫學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)方面的應(yīng)用。
單細(xì)胞研究|| 利用 Illumina?技術(shù)的近期單細(xì)胞研究文獻綜述（應(yīng)用二），主要介紹單細(xì)胞技術(shù)在藥物發(fā)現(xiàn)、生殖健康、微生物生態(tài)學(xué)和進化、植物生物學(xué)、法醫(yī)學(xué)、等位基因 – 特定基因表達方面的應(yīng)用。
分離單個細(xì)胞是單細(xì)胞測序工作流程的第一步，可通過多種技術(shù)實現(xiàn)。 189,190除現(xiàn)有的成熟技術(shù)（包括FACS、連續(xù)稀釋、微量吸取和LCM）以外，微流體和基于液滴的技術(shù)增加了單細(xì)胞測序工作流程的通量，在單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析中有更高的精確度和特異性。 191,192,193本節(jié)著重介紹一些用于從混懸液或組織分離單細(xì)胞的技術(shù)（表 1）。
表 1. 單細(xì)胞分離的方法
| 方法 | 描述 | 優(yōu)勢 | 缺點 | 成本 |
|---|---|---|---|---|
| FACS | 使用電荷分離的帶有單細(xì)胞的微滴 | 細(xì)胞表面標(biāo)記的特異性免疫標(biāo)志提高了準(zhǔn)確性 | ? 高通量需要特異性抗體 /標(biāo)記設(shè)備昂貴 | $$ |
| 連續(xù)稀釋 | 連續(xù)稀釋至每孔一個細(xì)胞 | 方法簡單 | 分離多個細(xì)胞的能力 不足 | $ |
| 口吸移液 | 使用玻璃移液管分離單個細(xì)胞 | 簡單方法 | 技術(shù)上困難 | $ |
| 自動顯微操作 | 自動微量移液管分離單個細(xì)胞 | 高精確度 | 低通量 | $$$ |
| 微流體平臺 | 微流體芯片分離流動槽中的細(xì)胞 | 從小體積樣本中分離細(xì)胞 高通量 |
要求細(xì)胞大小一致 、昂貴耗材 | $$$ |
| 光學(xué)鑷 | 離解的細(xì)胞懸液 | ? 細(xì)胞分離集中可控 ? 利用熒光標(biāo)記細(xì)胞 |
? 技術(shù)困難 ? 長期激光照射可損傷細(xì)胞 |
$$$ |
| 單核 | 從組織勻漿分離細(xì)胞核并通過FACS分選 | ? 柔和處理避免了基因\表達雜峰 ? 高通量 |
? 無法檢測出細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)本和小型 RNA | $$ |
| 納米過濾 | 過濾器上的尺寸排阻過濾 | ? 通過大小選擇細(xì)胞 | ? 細(xì)胞可粘附到過濾器上 | $ |
| Mag Sweeper | 帶EpCAM抗體的旋轉(zhuǎn)磁鐵 | ? 可富集罕見細(xì)胞 | ? 需要標(biāo)記才可分離 | $$ |
| 顯微操作 | 離解的細(xì)胞懸液 | ? 可從混合群體中分離多種細(xì)胞類型 | ? 低通量? 需要較大的起始量 | $ |
| TIVA201 | 活的單細(xì)胞中的光激活mRNA捕獲分子 | ? 可兼容活組織，保留 單細(xì)胞微環(huán)境? 非侵入性 | ? 低通量 | $$$ |
| CellSearch | 含抗體偶聯(lián)納米粒的磁鐵 | ? 高通量 | ? 對分離標(biāo)記存在偏 向性 | $$$ |
| CellCelector | 自動毛細(xì)管顯微操作器 | ? 高通量 | ? 昂貴 | $$$ |
| DEP-Array | 帶電介質(zhì)架的微芯片 | ? 高靈敏度，可分離罕見細(xì)胞 | ? 低通量 ? 耗時 | $$$$ |
| LCM | 在顯微鏡下通過激光從組織切片上切取細(xì)胞 | ? 可保留空間信息 | ? 技術(shù)困難 ? 對 RNA/DNA 有潛在的UV損傷 | $$$ |
參考文獻
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Binan L, Mazzaferri J, Choquet K, et al. Live single-cell laser tag. Nat Commun. 2016;7:11636由于單細(xì)胞測序法通常會導(dǎo)致細(xì)胞裂解和空間信息丟失，因此找到可在單細(xì)胞基因組分析中保留空間信息的方法及其重要。作者研發(fā)了一種通過光致漂白的細(xì)胞標(biāo)記（CLaP）法，將細(xì)胞標(biāo)記與單細(xì)胞基因組結(jié)合起來。培養(yǎng)中的單個細(xì)胞通過激光光致漂白標(biāo)記，然后基于大量不同特性分離。在本研究中，作者使用CLaP標(biāo)記大量單層生長細(xì)胞系的不同細(xì)胞。研究使用基于液滴的微流體分離單個細(xì)胞，并使用HiSeq 2500系統(tǒng)執(zhí)行RNA-Seq。將空間信息與單細(xì)胞基因組結(jié)合起來的能力使得該方法很好的適用于研究組織異質(zhì)性。
Illumina的技術(shù)：Nextera XT DNA Sample Preparation Kit、HiSeq 2500系統(tǒng)
Cottinet D, Condamine F, Bremond N, Griffiths AD, Rainey PB, et al. Lineage Tracking for Probing Heritable Phenotypes at Single-Cell Resolution. PLoS One. 2016;11:e0152395
確定單個微生物細(xì)胞的基因型和表型在了解微生物進化中至關(guān)重要。單細(xì)胞測序技術(shù)（包括WGS），當(dāng)前可以高分辨率檢測突變。但是，缺乏類似的表型分析方法。在本研究中，作者呈現(xiàn)了一種基于液滴的微流體系統(tǒng)，可在進化中的菌群中進行可遺傳表型的遺傳檢測。在各種時間點間隔，研究采樣細(xì)胞并在100 nL液滴中將其分離出來，隨后使用熒光蛋白報告基因監(jiān)測生長。作者使用該方法在 30 天的饑餓期間追蹤大腸桿菌菌群。數(shù)據(jù)顯示大腸桿菌的表型多樣性隨饑餓升高，而單細(xì)胞測序可確定每個表型類的相應(yīng)突變。
Illumina的技術(shù)：HiSeq 2500系統(tǒng)
- Bigdeli S, Dettloff RO, Frank CW, Davis RW and Crosby LD. A simple method for encapsulating single cells in alginate microspheres allows for direct PCR and whole genome amplification. PLoS One. 2015;10:e0117738
FACS后進行MDA，是當(dāng)前單細(xì)胞樣本處理的標(biāo)準(zhǔn)。由于高通量液體處理的試劑、耗材和設(shè)備成本升高，在單個孔中處理細(xì)胞可增加單細(xì)胞測序的成本。為降低平行單細(xì)胞測序的成本，作者研發(fā)了一種分離單細(xì)胞并大量制備DNA文庫、隨后分選的方法。研究將類球紅細(xì)菌細(xì)胞包被到海藻酸鹽微球中并進行MDA。研究將DNA從單個微球中提取出來，并使用MiSeq系統(tǒng)進行測序。該方法可改進從許多單個分離的細(xì)胞生成測序用DNA 的流程。
Illumina的技術(shù)：MiSeq 系統(tǒng)
- Bose S, Wan Z, Carr A, et al. Scalable microfluidics for single-cell RNA printing and sequencing. Genome Biol. 2015;16:120
在本研究中，作者展示了一種全新的可擴展的高密度微流體平臺，可在玻璃蓋玻片或多聚物微珠上固相捕獲RNA。研究將單細(xì)胞裂解產(chǎn)物吸入密封的皮升微孔中，這些微孔可在玻璃上復(fù)印RNA或在小球上捕獲RNA。研究將該樣本制備方法與基于CEL-Seq的可擴展的scRNA-Seq技術(shù)結(jié)合起來。該技術(shù)相對便宜，耗材成本為每個細(xì)胞 0.20，并可平行處理數(shù)百個單獨細(xì)胞。
Illumina的技術(shù)：TruSeq RNA-Seq Library Preparation Kit、NextSeq 500 和 HiSeq 2500 系統(tǒng)
+ Lee JH, Daugharthy ER, Scheiman J, et al. Fluorescent in situ sequencing (FISSEQ) of RNA for gene expression profiling in intact cells and tissues. Nat Protoc. 2015;10:442-458
scRNA-Seq可分析整個細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的基因表達，但細(xì)胞分離通常會導(dǎo)致空間信息的丟失。原位雜交是確定基因標(biāo)的位置的極佳技術(shù)，但限于固定數(shù)量的基因。在本研究中，作者展示了一種對細(xì)胞和組織中的基因表達進行原位分析的實驗方案。此方法中，在共聚焦顯微鏡下，將RNA人工轉(zhuǎn)化為交聯(lián)的cDNA擴增子并測序。該方法添加了看家 / 結(jié)構(gòu)基因環(huán)境特異性轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物富集的益處，同時保留了轉(zhuǎn)錄位置的組織結(jié)構(gòu)。
Illumina的技術(shù)：Nextera XT DNA Sample Preparation Kit、MiSeq系統(tǒng)
+ Nishikawa Y, Hosokawa M, Maruyama T, Yamagishi K, Mori T and Takeyama H. Monodisperse Picoliter Droplets for Low-Bias and Contamination-Free Reactions in Single-Cell Whole Genome Amplification. PLoS One. 2015;10:e0138733
WGA是單細(xì)胞測序流程的關(guān)鍵組成部分，而MDA是單細(xì)胞測序中最常用的WGA方法。盡管使用廣泛，由于擴展偏差和DNA嵌合體的形成，MDA通常產(chǎn)生不均勻的基因組覆蓋。為克服該限制，作者研發(fā)了液滴MDA，將這些技術(shù)雜峰降到最低。研究使用微流體將提取的DNA片段分離到67 pL液滴中，而單個片段則隨后使用MDA進行擴增。該方法通過測序大腸桿菌細(xì)胞的液滴MDA產(chǎn)物進行了驗證，與使用傳統(tǒng)MDA 59%的回收率相比，基因組回收率提高至 89%。
Illumina的技術(shù)：Nextera XT DNA Sample Preparation Kit、MiSeq系統(tǒng)
