基礎(chǔ)知識(shí)系列鏈接（節(jié)選）：
CRISPR-Cas9學(xué)習(xí)筆記
Cre-LoxP條件性基因編輯系統(tǒng)--學(xué)習(xí)筆記
FLP-FRT系統(tǒng)--誘導(dǎo)性基因編輯inducible gene editing
系列實(shí)驗(yàn)鏈接：
CRISPR-Cas9基因敲除sgRNA設(shè)計(jì)
CRISPR-Cas9（三）--sgRNA設(shè)計(jì)好之后
CRISPR-Cas9基因敲除實(shí)驗(yàn)步驟 day 1
CRISPR-Cas9基因敲除實(shí)驗(yàn)步驟 day 2
CRISPR-Cas9基因敲除實(shí)驗(yàn)步驟 day 3
CRISPR-Cas9基因敲除實(shí)驗(yàn)步驟 day 4
這里我不再放詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)步驟了，因?yàn)槲业膶?shí)驗(yàn)記錄本已經(jīng)詳細(xì)的記錄了實(shí)驗(yàn)步驟和條件，沒有多余的時(shí)間再重新弄一個(gè)，可以自行回去查找文獻(xiàn)對(duì)照protocol
上次我的day 4做完之后，接著就要轉(zhuǎn)293T細(xì)胞來驗(yàn)證一下質(zhì)粒的效果了。簡(jiǎn)單描述以下前期的思路（其實(shí)是我自己在回顧），先準(zhǔn)備好需要用的東西：Cas9 backbone質(zhì)粒，根據(jù)基因靶點(diǎn)將sgRNA設(shè)計(jì)好（順帶設(shè)計(jì)一下引物），將sgRNA插入到Cas9 backone質(zhì)粒中，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞擴(kuò)增，提取質(zhì)粒后酶切驗(yàn)證。接著就是293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染驗(yàn)證了。
其實(shí)就是簡(jiǎn)單的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
使用常規(guī)的轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000或者羅氏等其他公司的轉(zhuǎn)染試劑，按照protocol嚴(yán)格操作即可。
1. 注意293T細(xì)胞非常脆弱，動(dòng)作要輕柔。
2. 但我為啥做了10天呢。。。293T細(xì)胞是非常好轉(zhuǎn)的細(xì)胞，可是我仍然做了好一段時(shí)間才達(dá)到了所需的轉(zhuǎn)染效率，這跟轉(zhuǎn)染試劑的效率有關(guān)。盡量使用新開封的試劑。
3. 另外293T細(xì)胞的狀態(tài)也很重要。
4. 細(xì)胞融合度：如果按照protocol，在轉(zhuǎn)染當(dāng)天70-90的細(xì)胞融合度，那就妥妥的12小時(shí)之后就長爆了，根本沒法在孔板里面待夠72小時(shí)。細(xì)胞一旦超過50%之后就快速增殖了，因此我選擇了45%進(jìn)行轉(zhuǎn)染，24-48 h細(xì)胞并不是非常的滿，72 h細(xì)胞還是OK的。
昨天和今天都提取了基因組DNA，就醬紫。
感謝師兄DZ
