眾所周知，一個(gè)公司開通公眾號(hào)的目的肯定是營銷，我們也是（真的）。小編給自己起了個(gè)名字“BigM”后就開始想方案。著名的營銷學(xué)之父Philip Kotler認(rèn)為“優(yōu)秀的企業(yè)滿足需求，杰出的企業(yè)創(chuàng)造市場(chǎng)”。
所以BigM覺得先要用通俗易懂的語言，把什么是單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序給大家講懂了，才能激發(fā)你們的需求，創(chuàng)造我們的市場(chǎng)。就這樣，我們的第一個(gè)系列板塊“白話單細(xì)胞”誕生了，代號(hào)Vernacular（白話）。
通常我們搜索單細(xì)胞測(cè)序時(shí)，十家公司中有九家都會(huì)展示封面這張微流控示意圖，告訴大家我們用的是最主流且穩(wěn)定的10x Genomics單細(xì)胞捕獲技術(shù)（當(dāng)然，奇景生物也是這么做的）。今天咱們的主角就是這張圖，先說一說這神奇的微流控技術(shù)怎么就能捕獲單細(xì)胞了？
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?圖1
要捕獲單細(xì)胞先得準(zhǔn)備幾樣?xùn)|西，主要是Gel Beads、Oil和要被捕獲的細(xì)胞們（Cells）。圖1中從管道左側(cè)進(jìn)入的小圓球就是Gel Beads，五顏六色可不是為了好看，而是代表著每個(gè)Gel Beads都不一樣。
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 圖2
每個(gè)Gel Bead表面都長著非常多的小觸角（Primer），常用的是圖2右側(cè)最上面那種Poly(dT) primer。區(qū)分細(xì)胞的關(guān)鍵就在圖2中綠色的10x BC（Barcode序列標(biāo)簽），同一個(gè)Gel Bead上的小觸角中Barcode序列完全相同。而圖2中橙色的UMI序列標(biāo)簽用于測(cè)序后定量，同一個(gè)Gel Bead上的小觸角中UMI各不相同。Poly(dT)就不用說了，抓細(xì)胞中帶PloyA尾的那些RNA用的。
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?圖3
萬事俱備，只欠東風(fēng)。這東風(fēng)來自空氣泵，可以將Gel Beads和Cells均勻的沿著不同微流控孔道進(jìn)行推送，一個(gè)Gel Bead遇到一個(gè)Cell，最終在油井（圖1中Oil in Well）里配對(duì)結(jié)緣形成“油包水”結(jié)構(gòu)。接下來發(fā)生的事情就順理成章了，Gel Beads釋放內(nèi)部的化學(xué)物質(zhì)使細(xì)胞破裂并釋放RNA。小觸角用Poly(dT)抓住帶PloyA尾的RNA，通過反轉(zhuǎn)錄形成cDNA，并帶上了Barcode和UMI標(biāo)簽（圖3）。
測(cè)序得到的序列（Reads）中，不僅有RNA序列，還有對(duì)應(yīng)的Barcode和UMI標(biāo)簽。RNA序列與參考基因組比對(duì)，確定來自于哪個(gè)基因。同時(shí)，將這些序列按照Barcode歸歸類，相同Barcode的序列來自于同一個(gè)細(xì)胞。另外，還記得嗎？Gel Bead上UMI各不相同，如果同一個(gè)細(xì)胞中的序列有相同的UMI，那大概率是PCR引入的重復(fù)，我們只計(jì)數(shù)一次，矯正計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。這樣，我們就得到了單個(gè)細(xì)胞維度，不同基因的準(zhǔn)確表達(dá)量了。
看到這里10x Genomics單細(xì)胞捕獲的原理差不多講完了，如果大伙覺得聽明白了，請(qǐng)關(guān)注+轉(zhuǎn)發(fā)，BigM吃個(gè)雞腿以后還能再講三百回合。想上“提高班”的話，可以留下來再聽兩句。
10x Genomics技術(shù)確實(shí)不錯(cuò)，但會(huì)出現(xiàn)哪些常見問題？
01 多細(xì)胞｜細(xì)胞們不一定會(huì)老老實(shí)實(shí)的束手就擒，總會(huì)做一些搗亂的事情，比如多個(gè)細(xì)胞和一個(gè)Gel Bead配對(duì)形成油包水結(jié)構(gòu)。來自多個(gè)細(xì)胞的RNA，由于具有相同的Barcode，會(huì)被認(rèn)為是單個(gè)細(xì)胞的RNA表達(dá)量，影響后續(xù)分析。這樣該怎么辦呢？
拆招：微流控推送Gel Beads的速率通常會(huì)高于細(xì)胞，寧愿找不到細(xì)胞配對(duì)，也別讓多個(gè)細(xì)胞爭(zhēng)搶一個(gè)Gel Bead。通過這種方法，每一萬個(gè)細(xì)胞中多細(xì)胞率通?？梢钥刂圃?%以下。除此之外，我們?cè)诜治鲋幸部梢允褂肈oubletFinder等軟件，從算法上預(yù)測(cè)多細(xì)胞數(shù)據(jù)，并進(jìn)行去除。
02? 背景噪音｜等待被捕獲的Cells之間，混有一些游離的RNA。（這種情況如何去除）這些RNA與細(xì)胞一起進(jìn)入油包水結(jié)構(gòu)，并被標(biāo)記上Barcode和UMI進(jìn)行測(cè)序。甚至油包水結(jié)構(gòu)中沒有細(xì)胞，而只有游離RNA被捕獲測(cè)序。
拆招：在樣本獲取、運(yùn)輸、制備過程中，保證細(xì)胞活性，避免死亡或破碎細(xì)胞中的RNA游離出來。同時(shí)，對(duì)于細(xì)胞活性較低的樣本，我們也可以采用去死細(xì)胞的方法對(duì)樣本進(jìn)行處理，提高細(xì)胞活性。除此之外，在Cell Ranger進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)分析環(huán)節(jié)，我們也可以對(duì)背景噪音進(jìn)行去除。
關(guān)注+轉(zhuǎn)發(fā)，下期“Vernacular｜白話單細(xì)胞”再約。
