一般KO（Knockout，基因敲除）小鼠的設(shè)計(jì)并沒有一個(gè)“一刀切”的答案，具體從哪個(gè)外顯子開始、敲掉多少個(gè)外顯子，取決于目標(biāo)基因的結(jié)構(gòu)和想要達(dá)到的敲除效果。
普遍遵循的設(shè)計(jì)原則和策略如下：
核心設(shè)計(jì)目標(biāo)
KO設(shè)計(jì)的最終目標(biāo)是：徹底破壞目標(biāo)基因的功能，使其無法產(chǎn)生有功能的蛋白質(zhì)（通常是完全缺失或產(chǎn)生截短且無功能的肽段）。
1. 從哪個(gè)外顯子開始？
通常不會(huì)從第一個(gè)外顯子開始，而是選擇第二個(gè)或第三個(gè)編碼外顯子（Coding Exon），目的為：
1）避免影響調(diào)控元件：第一個(gè)外顯子通常包含5‘非翻譯區(qū)（5’ UTR）和啟動(dòng)子區(qū)域附近的重要調(diào)控序列。直接刪除第一個(gè)外顯子可能會(huì)意外破壞這些調(diào)控元件，影響鄰近基因的表達(dá)，導(dǎo)致表型分析復(fù)雜化。
2）確保移碼：選擇靠前的編碼外顯子進(jìn)行敲除，可以最大化地導(dǎo)致其后的所有外顯子讀碼框（Reading Frame）移位，從而在最上游就破壞整個(gè)基因的翻譯。
3）通用性強(qiáng)：很多基因有多個(gè)轉(zhuǎn)錄本（剪接變體），選擇第二個(gè)或第三個(gè)保守的外顯子進(jìn)行敲除，通?？梢源_保敲掉該基因的所有（或絕大多數(shù)）主要轉(zhuǎn)錄本，避免因選擇性剪接而產(chǎn)生漏網(wǎng)之魚（有功能的截短蛋白）。
例外情況：如果目標(biāo)基因的特定功能域由某個(gè)后面的外顯子編碼，而實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼茄芯吭摴δ苡颍敲丛O(shè)計(jì)時(shí)會(huì)特異性刪除那個(gè)包含功能域的外顯子。
2. 敲掉多少個(gè)外顯子？
通常至少敲除一個(gè)完整的外顯子，但更常見的做法是敲除兩個(gè)或以上的外顯子。
為什么？
防止通讀（Read-Through）和功能補(bǔ)償：這是最關(guān)鍵的原因。
如果只敲除一個(gè)外顯子，細(xì)胞有時(shí)會(huì)通過“外顯子跳躍”（Exon Skipping）的方式，在mRNA剪接時(shí)跳過被敲除的外顯子，從而產(chǎn)生一個(gè)缺失部分氨基酸但仍保留讀碼框的蛋白質(zhì)。這個(gè)蛋白可能仍具有部分或全部功能（稱為“滲漏”現(xiàn)象），導(dǎo)致敲除不徹底。
敲除多個(gè)連續(xù)的外顯子（例如，刪除Exon 3-5）可以極大程度地防止這種“外顯子跳躍”的發(fā)生，因?yàn)樘S這么大片段會(huì)完全破壞mRNA結(jié)構(gòu)，或者即使發(fā)生跳躍，也必然導(dǎo)致移碼，從而確保產(chǎn)生無功能的截短蛋白。
確保移碼和提前終止：刪除多個(gè)外顯子可以確保編碼序列長(zhǎng)度發(fā)生巨大變化，并在刪除片段之后立即引入提前終止密碼子（Premature Stop Codon）。這樣產(chǎn)生的mRNA會(huì)觸發(fā)的無義介導(dǎo)的mRNA降解（Nonsense-Mediated mRNA Decay, NMD）機(jī)制被降解，即使不降解，翻譯出的蛋白也是毫無功能的。
總結(jié)：通用設(shè)計(jì)策略
一個(gè)穩(wěn)健的、適用于大多數(shù)蛋白編碼基因的KO策略是：
1）選擇目標(biāo)區(qū)域：選擇第二個(gè)或第三個(gè)編碼外顯子作為靶點(diǎn)。
2）確定刪除范圍：刪除該外顯子及其下游的一個(gè)或多個(gè)外顯子（例如，刪除Exon 2-4）。通常刪除的DNA片段長(zhǎng)度在1kb到幾個(gè)kb之間。
3）驗(yàn)證設(shè)計(jì)：
確保刪除后會(huì)引入移碼。
確保在刪除片段之后很快會(huì)出現(xiàn)提前終止密碼子。
使用生物信息學(xué)工具檢查是否會(huì)影響該基因的其他重要轉(zhuǎn)錄本或鄰近基因。
總之，KO鼠的設(shè)計(jì)是一個(gè)精心策劃的過程，從Exon 2-4開始，敲掉2-3個(gè)外顯子是一個(gè)非常常見且有效的策略，可以最大限度地確保獲得完全性基因敲除小鼠。最終方案必須根據(jù)具體基因進(jìn)行個(gè)性化設(shè)計(jì)。在開始實(shí)驗(yàn)前，查閱國(guó)際KO小鼠計(jì)劃（如IKMC）中已成功的項(xiàng)目設(shè)計(jì)是非常好的參考。
