細胞系基因編輯是基因編輯和修飾里面效率最高、最簡便、成本最低、最容易上手的技術(shù)之一。CRISPR-CAS9是細菌防御病毒的一種手段，病毒作為外來物病毒DNA進入細菌時，它會被加工成更小的片段，可能會被插入細菌基因組的一個被稱為CRISPR位點的區(qū)域，當該區(qū)域被轉(zhuǎn)錄時，產(chǎn)物與稱為tracrRNA的小RNA結(jié)合，將CAS9蛋白和RNA定位到分子上。

每個復合物都由CAS9蛋白、tracrRNA和gRNA組成。這些結(jié)構(gòu)中的crRNA識別并引導CAS9切開病毒DNA?？茖W家們通過模仿tracrRNA和crRNA的單個RNA分子（gRNA）使用CRISPR-CAS9系統(tǒng)。例如當兩個這樣的引導RNA被引入到CAS9的細胞中并且都針對相同的基因時一個序列可以被切除，一旦這個目標區(qū)域被移除，切斷的末端會發(fā)生非同源末端連接（NHEJ）修復或者同源定向修復（HDR）。

一、細胞株基因敲除實驗流程：

???基因敲除離不開基因編輯系統(tǒng)，在人工構(gòu)建的CRISPR-CAS9系統(tǒng)載體中，crRNA+tracrRNA融合為一條，稱為導向RNA（guide RNA，gRNA），我們常說的gRNA其實就是crisprRNA中識別宿主靶點的序列。

二、雙靶點sgRNA敲除細胞株的兩種類型

經(jīng)過編輯的細胞系經(jīng)挑取單克隆進行培養(yǎng)，發(fā)生基因編輯的細胞株基因組切斷的末端會發(fā)生非同源末端連接（NHEJ）修復或者同源定向修復（HDR）。對于敲出片段的大小不同，會有以下兩種情況：

1.移碼敲除:敲除的細胞株因NHEJ會在兩個sgRNA的切割位置引入indels，與野生型未敲除的基因組相比，外顯子區(qū)域插入或缺失的堿基數(shù)為非3整數(shù)倍會導致閱讀框的移碼，導致該基因被敲除。

2.精確的片段敲除：敲除的細胞株在切割位點發(fā)生精確切割且無indels引入，也無同源定向修復（HDR），最終基因組切割片段與設(shè)計的切割片段完全吻合。

三、雙靶點sgRNA基因敲除如何PCR鑒定？

PCR鑒定雙靶點sgRNA基因敲除的基本原則是利用基因敲除株基因組與野生型基因組的序列差異，以基因敲除株基因組DNA為模板進行PCR，并以凝膠電泳對比不同基因型特異產(chǎn)物的大小，根據(jù)條帶大小來初步區(qū)分不同基因型。

1：junction引物設(shè)計

將引物設(shè)計在敲除區(qū)域的內(nèi)外側(cè)，即一條引物位于敲除片段內(nèi)側(cè)，一條引物位于敲除片段外側(cè)。該對引物可用于敲除細胞株的初步篩選，篩除敲除片段仍然存在的未編輯克隆。較短的敲除片段，例如敲除大?。?0bp，NHEJ引入的indels會使得junction引物其中的一條的模板大概率發(fā)生改變，從而使得juntion引物無法擴增出目的條帶。

2：KO引物設(shè)計

將引物設(shè)計在敲除區(qū)域的上下游外側(cè)，即兩條引物位于敲除片段不同外側(cè)。該對引物可用于檢測敲除細胞株敲除片段是否被精確敲除。較短的敲除片段，KO片段需經(jīng)過測序及生信分析得到最終編輯結(jié)果。

舉例說明：

如上圖所示，A基因敲除大小為156 bp，外顯子敲除106 bp。

設(shè)計的junction引物位于敲除片段內(nèi)外側(cè)，野生型為模板的junction F/R擴增產(chǎn)物大小為281 bp。

設(shè)計的KO引物位于敲除片段兩端外側(cè)，野生型為模板的 KO F/R擴增產(chǎn)物大小為426 bp，被敲除的基因組模板為426 bp減去156 bp為270bp。

實際檢測結(jié)果如下圖所示：

16號單克隆細胞株Junction引物PCR擴增結(jié)果為陰性，表明16號克隆很有可能發(fā)生了編輯。

結(jié)合KO引物PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果判斷，16號單克隆細胞株KO引物PCR擴增產(chǎn)物略大于250bp marker，符合敲除后270 bp PCR擴增產(chǎn)物大小，下一步可進行膠回收送測序，進一步確定其基因型。

四、雙靶點sgRNA基因敲除PCR鑒定操作步驟

（1）檢測敲除的混合克隆樣本；

使用按照上述方法設(shè)計的引物對基因敲除的細胞系進行混合克隆PCR初步鑒定。

將適量的混合克隆細胞（1～10萬個細胞）移入1.5mL的離心管中，8000 rpm/min 離心5min左右，棄掉培養(yǎng)基（此處不應殘留培養(yǎng)基），加入約100ul的細胞快速裂解液（GC231000459），吹打均勻。將分散有細胞的裂解液水浴55℃ 30min,95℃ 10min。即可制備出可用于基因敲除PCR鑒定使用的基因組模板。

如果瓊脂糖凝膠電泳可以觀察到符合敲除后的KO引物擴增大小的條帶，則說明此處極大發(fā)生了基因編輯，經(jīng)測序后即可驗證即此混合克隆樣本中是否發(fā)生敲除，如果混合克隆發(fā)生了敲除編輯，則可進入下一步單克隆細胞株篩選；如果只有JC擴增產(chǎn)物條帶和未敲除的KO引物擴增大小，則說明此處未發(fā)生基因編輯或發(fā)生編輯細胞在混合克隆樣本中的占比極低，即此混合克隆沒有敲除效率或挑到相應純合克隆細胞株的概率極低。

舉例說明：

B基因雙gRNA敲除片段大小為862 bp，KO引物在未編輯基因組上擴增產(chǎn)物大小為1256bp，使用未編輯的野生型細胞裂解液模板作為KO引物的陽性對照。

如果混合克隆中大量細胞發(fā)生了基因編輯，雙gRNA編輯的混合克隆裂解液模板的擴增條帶大小應為1256bp減去862bp，即394bp。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳觀察到符合敲除后KO擴增產(chǎn)物大小的目的條帶。

回收目的條帶送測后，進一步確定，該條帶確為雙gRNA發(fā)生精確切割后的KO條帶，證明混合克隆中發(fā)生了大規(guī)模的敲除編輯事件。

（2）將有敲除效率的混合克隆做單克隆細胞株篩選并驗證。

將上一步有敲除效率的混合克隆用有限稀釋法進行單克隆篩選。單克隆細胞株生長至適宜細胞數(shù)量即可進行PCR鑒定。單克隆篩選的模板裂解方式和程序可參考混合克隆。

由于在篩選單克隆時存在樣本數(shù)量較大，操作耗時長等問題，本方法能夠解決這些問題，樣本裂解迅速、快捷，制備的樣品模板實驗結(jié)果準確可靠。

首先推薦使用junction引物對單克隆細胞株進行篩選，以排除大量的雜合子和未編輯細胞株。（Junction引物擴增陰性的單克隆樣本：下圖中的1、18、25)

其次，對Junction引物擴增陰性的單克隆樣本再使用KO引物進行擴增。根據(jù)敲除片段的大小，以及實際上可能出現(xiàn)的敲除方式進行檢測（精確敲除或移碼突變）。

舉例說明：

C基因和D基因的單克隆經(jīng)juntion引物初篩后，進行juntion引物擴增復檢和KO擴增，出現(xiàn)與敲除后KO擴增條帶大小吻合的目的條帶，這類目的條帶即可進行測序檢測。

測序結(jié)果進行生信分析，結(jié)果表明D基因敲除的1號單克隆細胞株為敲除純合子。

后續(xù)也可進行Western Blot進行進一步驗證，但Western Blot結(jié)果陰性只能作為敲除成功的充分條件而非必要條件。

五、基恩科生物提供基于sgRNA敲除的相關(guān)產(chǎn)品