Science | 老年人失眠的腦神經(jīng)機(jī)制

原創(chuàng)?舊島望月亮?圖靈基因?2022-03-24 10:42

收錄于話題#前沿分子生物學(xué)機(jī)制

撰文：舊島望月亮

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亮點(diǎn):

1.作者闡明了老年個體睡眠碎片化的腦神經(jīng)機(jī)制和分子機(jī)制。

2.研究中使用的KCNQ選擇性激活劑有望成為治療失眠的候選藥物，提升老年人的睡眠質(zhì)量。

睡眠質(zhì)量下降尤其是夜晚睡眠的碎片化，降低了老年人的幸福感。然而，與衰老相關(guān)的睡眠碎片化機(jī)制尚不清楚。2022年2月25日斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院Luis deLecea等人利用光遺傳、電生理等技術(shù)揭示了老年個體睡眠碎片化的腦神經(jīng)機(jī)制和分子機(jī)制，為治療失眠提供了新的思路。其研究結(jié)果發(fā)表在名為”Hyperexcitable arousal circuits drive sleep instability during aging”的文章中。

首先，作者了比較幼齡(3~5月)和老齡(18~22月)野生型小鼠在睡覺時睡眠/覺醒階段的腦電圖，發(fā)現(xiàn)老齡小鼠的睡眠成碎片化。具體表現(xiàn)為處于NREM*睡眠階段和覺醒階段的平均時間更短，而在兩者之間轉(zhuǎn)換的次數(shù)更多。外側(cè)下丘腦(LH)中的食欲素(Hcrt)神經(jīng)元在控制睡眠/覺醒中起著關(guān)鍵作用。利用Hcrt1抗體對上述小鼠的腦片進(jìn)行染色，發(fā)現(xiàn)與幼齡小鼠相比，老齡小鼠的Hcrt神經(jīng)元數(shù)量顯著降低。接著，作者記錄了幼齡和老齡Hcrt::Cre小鼠*在睡覺時的腦電圖*，并利用光纖記錄了GCaMP6f信號*，發(fā)現(xiàn)老齡小鼠碎片化的睡眠模式與Hcrt神經(jīng)元興奮性的增強(qiáng)有關(guān)(圖1)。具體而言，在幼齡和老齡小鼠Hcrt神經(jīng)元中都發(fā)現(xiàn)了睡眠階段的GCaMP6f信號(GS)和覺醒階段的GCaMP6f信號(GW)。老齡組GCaMP6f在兩個時期的振幅較小(圖1c和d)，說明其Hcrt神經(jīng)元激活的閾值較低，這使睡眠與覺醒之間的相互轉(zhuǎn)換更為容易。此外，老齡小鼠的GW頻率顯著高于幼齡小鼠，而GS頻率在兩者之間沒有顯著差異(圖1c和d，右下角)。線性擬合相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，睡眠時間與GW頻率呈負(fù)相關(guān)(圖1f)，表明睡眠時間的縮短可能是因為Hcrt神經(jīng)元的過度興奮。

*NREM：根據(jù)腦電圖特征，睡眠分為非快速眼動睡眠(NREM)和快速眼動睡眠(REM)。前者包括睡眠的第一到第四階段，后者會出現(xiàn)眼球快速運(yùn)動并通常伴隨夢境的產(chǎn)生。

*Hcrt::Cre小鼠：利用Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)對小鼠腦內(nèi)的Hcrt神經(jīng)元上的基因序列進(jìn)行重組或敲除。Cre重組酶能在催化DNA鏈交換過程中，特異性識別DNA上的LoxP位點(diǎn)。并與其共價結(jié)合，對LoxP位點(diǎn)間的基因序列進(jìn)行操縱。

*腦電圖和統(tǒng)計分析表明Hcrt::Cre小鼠模型中，老齡小鼠的睡眠仍然成碎片化(圖1a、1b和1e)。

*GCaMP6f：一種鈣敏感的熒光蛋白，能特異性地反映細(xì)胞內(nèi)游離的鈣離子濃度變化。目前常被用于表征神經(jīng)元的活動狀態(tài)。

圖1?幼齡和老齡小鼠睡眠/覺醒階段Hcrt神經(jīng)元的自發(fā)活動

接著，作者試圖研究激活Hcrt神經(jīng)元對小鼠睡眠模式的影響。將編碼AAV-DIO-ChR2的病毒*注射到幼齡和老齡Hcrt::Cre小鼠的外側(cè)下丘腦。在NREM(圖2a-f)和REM階段(圖2g-l)，用一系列強(qiáng)度和頻率不同的藍(lán)光刺激幼齡和老齡小鼠的Hcrt神經(jīng)元，并記錄該過程的腦電活動。高強(qiáng)度和高頻率的刺激能立即引起幼齡和老齡小鼠NREM/REM睡眠向覺醒的轉(zhuǎn)換(圖2a和g)。而在不同強(qiáng)度和頻率的光刺激下，老齡小鼠從睡眠向覺醒轉(zhuǎn)換的潛伏期更短(圖2b-c、h-i)。在NREM(圖2f)和REM(圖2l)階段，激活Hcrt神經(jīng)元顯著延長了老齡小鼠的覺醒時間。此外與老齡小鼠相比，幼齡小鼠需要更強(qiáng)的光刺激才能誘發(fā)相同的覺醒時間(圖2d、2J)。上述結(jié)果進(jìn)一步證實了老齡小鼠睡眠/覺醒的相互轉(zhuǎn)化與Hcrt神經(jīng)元過度興奮之間的關(guān)系。

*AAV-DIO-ChR2：該病毒能使Hcrt神經(jīng)元受藍(lán)光刺激而激活。AAV即腺相關(guān)病毒載體，能感染神經(jīng)細(xì)胞并沿著神經(jīng)環(huán)路傳播。DIO是與Cre配合來控制目的基因(ChR2)表達(dá)的元件。在Cre存在的情況下，對原有基因進(jìn)行敲除，并插入病毒攜帶的基因序列。ChR2是一類光敏感通道蛋白。它能在藍(lán)光刺激下使陽離子通道開放，產(chǎn)生內(nèi)向電流，進(jìn)而激活神經(jīng)元。

圖2?光遺傳刺激Hcrt神經(jīng)元對小鼠睡眠模式的影響

為了探究Hcrt神經(jīng)元的興奮性是否受年齡的影響，作者用全細(xì)胞膜片鉗記錄了幼齡和老齡Hcrt::Cre小鼠腦片的Hcrt神經(jīng)元的自發(fā)神經(jīng)活動。結(jié)果發(fā)現(xiàn)老齡小鼠Hcrt神經(jīng)元自發(fā)放電比例高于幼齡小鼠(圖3a)。并且在相同的輸入電阻下，老齡組Hcrt神經(jīng)元的靜息膜電位(RMP)的去極化水平更高(圖3c和3d)。由于兩組神經(jīng)元的閾值沒有顯著性差異，因此在老齡組Hcrt神經(jīng)元中RMP與閾值之間的差異更小(圖3e和3f)。即更小的去極化就能使老齡組Hcrt神經(jīng)元激發(fā)到動作電位(AP)，表現(xiàn)為該神經(jīng)元的AP振幅更高(圖3b和3g)。而AP的其它特性在兩組間之間沒有差異(圖3h-k)。

作者推測兩組小鼠神經(jīng)元興奮性的差異是由電壓門控鉀離子通道(KCNQ)*介導(dǎo)K+電流引起的。為了驗證這一想法，作者對幼齡和老齡小鼠腦片中的Hcrt神經(jīng)元使用KCNQ2/3的選擇性調(diào)節(jié)劑。灌流KCNQ2/3選擇性阻斷劑XE991顯著增加了幼齡組Hcrt神經(jīng)元的RMP極化水平并提高了放電頻率(圖3l-n)。相反，KCNQ2/3選擇性激活劑flupirtin使老齡組Hcrt神經(jīng)元的RMP超極化并降低了放電頻率(圖3o-q)。單核RNA測序結(jié)果表明兩組KCNQ的表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異，但老齡組Hcrt神經(jīng)元表達(dá)KCNQ2、KCNQ3 mRNAs的比例更低，這可能是老齡組小鼠Hcrt神經(jīng)元過度興奮的原因之一。

*哺乳動物體內(nèi)有五種亞型的KCNQ，分別是KCNQ1-KCNQ5。其中KCNQ2與KCNQ3能配對形成KCNQ2/3異構(gòu)體，在調(diào)節(jié)神經(jīng)元閾下興奮性、復(fù)極化和突觸間信號輸入的敏感性方面發(fā)揮重要作用。

圖3?老齡小鼠Hcrt神經(jīng)元的興奮性增強(qiáng)與電壓門控離子通道

鑒于KCNQ通道在大腦中的廣泛表達(dá)，作者試圖探討Hcrt神經(jīng)元中該通道對睡眠模式的影響。將不同胎次的Hcrt::Cre幼齡小鼠隨機(jī)分為兩組，其中一組利用CRISPR/SaCas9*特異性敲除小鼠Hcrt神經(jīng)元中的KCNQ2/3基因，另一組注射僅帶有mCherry*的病毒載體作為對照(圖4a)。比較兩組小鼠睡眠/覺醒階段的腦電圖，發(fā)現(xiàn)敲除Hcrt神經(jīng)元中KCNQ2/3基因使幼齡小鼠在NREM階段出現(xiàn)睡眠碎片化(圖4b)。然后對mCherry標(biāo)記的Hcrt神經(jīng)元(圖4c)進(jìn)行全細(xì)胞記錄，發(fā)現(xiàn)敲除KCNQ2/3基因的Hcrt神經(jīng)元表現(xiàn)為RMP的去極化水平和自發(fā)放電活動增加(圖4d和4e)。上述結(jié)果表明特異性敲除Hcrt神經(jīng)元的KCNQ2/3基因，使幼齡小鼠表現(xiàn)出與老齡小鼠相似的睡眠模式。

*CRISPR/Cas9是一種對目的基因進(jìn)行編輯的技術(shù)。CRISPR是細(xì)菌和古細(xì)菌為應(yīng)對病毒入侵演化而來的免疫防御機(jī)制。它通過合成一個與特定DNA互補(bǔ)的gRNA，將CRISPR cas9蛋白靶向到目標(biāo)位點(diǎn)。并切割DNA雙鏈提高該位點(diǎn)的重組效率，從而利用細(xì)胞的同源重組機(jī)制進(jìn)行基因組編輯。而CRISPR/SaCas9屬于上述基因編輯技術(shù)的一種，可以用于敲除小鼠的目標(biāo)基因。

*mCherry：一種紅色熒光蛋白，常被用于標(biāo)記某些細(xì)胞和分子。

圖4?Hcrt神經(jīng)元中KCNQ2/3通道對睡眠模式的影響

為了進(jìn)一步驗證KCNQ2/3通道在睡眠調(diào)節(jié)中的作用，作者研究了KCNQ2/3配體在體內(nèi)的藥理作用。結(jié)果表明，與對照組(生理鹽水)相比，注射XE991顯著增加了幼齡野生型小鼠的覺醒次數(shù)(圖5a)。此外，與對照組(二甲基亞砜)相比，flupirtine顯著增加了老齡野生型小鼠NREM的數(shù)量和穩(wěn)定性(圖5b)。由于睡眠質(zhì)量與認(rèn)知功能相關(guān)，在物體識別任務(wù)中給予老齡小鼠flupirtine促進(jìn)了其對新物體的探索(圖5c-e)。除此之外，幼齡時期病理性缺失Hcrt神經(jīng)元會導(dǎo)致I型嗜睡癥。該疾病表現(xiàn)為白天過度嗜睡，突然失去肌張力，并且腦電圖上出現(xiàn)類似REM階段的腦電波。盡管健康的老齡小鼠和患有嗜睡癥的幼齡小鼠都表現(xiàn)出睡眠碎片化，但研究發(fā)現(xiàn)二者潛在的機(jī)制并不相同。

圖6 KCNQ2/3配體在體內(nèi)的藥理作用

該文章揭示了過度興奮的Hcrt神經(jīng)元會導(dǎo)致睡眠碎片化。首先，老齡小鼠Hcrt神經(jīng)元的神經(jīng)興奮性增強(qiáng)，且光遺傳激活后覺醒時間延長。接著，研究發(fā)現(xiàn)老齡小鼠Hcrt神經(jīng)元表現(xiàn)出的高度興奮性與KCNQ2/3表達(dá)降低有關(guān)。特異性敲除幼齡小鼠Hcrt神經(jīng)元中的KCNQ2/3基因破壞了睡眠的穩(wěn)定性。而KCNQ選擇性激活劑flupirtin使Hcrt神經(jīng)元超極化，從而促進(jìn)了老齡小鼠的睡眠。此外有研究表明，與對照組相比，阿爾茨海默癥患者的Hcrt神經(jīng)元數(shù)量顯著降低。作者推測阿爾茲海默癥可能會加劇老齡患者的睡眠片段化。

教授介紹

Luis de Lecea為斯坦福大學(xué)精神病學(xué)和行為科學(xué)教授。他于1991年獲得巴塞羅那大學(xué)分子生物學(xué)博士。Luis de Lecea所在課題組通過分子、光遺傳學(xué)、解剖學(xué)和行為學(xué)等方法研究大腦覺醒的神經(jīng)環(huán)路，其成果發(fā)表在Science、Nature、eLife等期刊上。因其對科學(xué)研究的貢獻(xiàn)，2013年獲美國國家精神疾病研究學(xué)會(NARSAD)的杰出研究者獎，并于2015年成為富布賴特高級研究員。

參考文獻(xiàn)

Li SB, Damonte VM, Chen C, et al.Hyperexcitable arousal circuits drive sleep instability during aging. Science.2022;375(6583). doi:10.1126/science.abh3021