Nat Biotech | 深部組織多光子成像非侵入式研究大腦結(jié)構(gòu)和功能

原創(chuàng)?huacishu?圖靈基因?2022-06-26 10:50?發(fā)表于江蘇

收錄于合集#前沿分子生物學(xué)技術(shù)

撰文：huacishu

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亮點(diǎn)：

1、作者在多項(xiàng)?AO?顯微成像技術(shù)的基礎(chǔ)上，開發(fā)了一種新型活體自適應(yīng)光學(xué)三光子顯微成像（AO-3PM）系統(tǒng)，該系統(tǒng)結(jié)合全新自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)和三光子顯微成像，實(shí)現(xiàn)了穿過活體小鼠完整頭骨在大腦深層的高分辨率成像；

2、該系統(tǒng)大幅提升了非侵入式活體成像的圖像質(zhì)量，為無損的研究大腦結(jié)構(gòu)和功能提供了強(qiáng)有力的工具和方法。

香港科技大學(xué)Jianan Y. Qu（瞿佳男）教授課題組在國際知名期刊Nat Biotechnol在線發(fā)表題為“Deep tissue multi-photon imaging using adaptive optics with direct focus sensing and shaping”的論文。由于生物物質(zhì)的復(fù)雜結(jié)構(gòu)引起的光學(xué)像差和光散射，組織深處的高分辨率光學(xué)成像成為了一個具有挑戰(zhàn)性的問題。本研究作者提出了一種自適應(yīng)光學(xué)三光子顯微鏡（ALPHA-FSS），ALPHA-FSS可準(zhǔn)確測量并有效補(bǔ)償標(biāo)本引起的像差和散射，并恢復(fù)亞細(xì)胞分辨率。具有遠(yuǎn)程聚焦的共軛自適應(yīng)光學(xué)配置能夠通過完整顱骨下方750μm的深度對小鼠皮質(zhì)中的精細(xì)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)進(jìn)行活體成像，從而實(shí)現(xiàn)皮質(zhì)中的近無創(chuàng)高分辨率顯微鏡檢查。作者還展示了通過完整顱骨進(jìn)行高靈敏度和高精度激光介導(dǎo)顯微手術(shù)的功能性鈣成像。此外，還實(shí)現(xiàn)了完整腦內(nèi)深皮質(zhì)和皮質(zhì)下海馬體的活體高分辨率成像。

作者提出的共軛α-FSS–3PM系統(tǒng)由三個關(guān)鍵模塊組成，即直接聚焦傳感、共軛自適應(yīng)光學(xué)（AO）和遠(yuǎn)程聚焦模塊，如圖1a所示。為了評估α-FSS–3PM的效果并表征其在穿透顱骨成像中的性能，作者首先進(jìn)行了一項(xiàng)體外實(shí)驗(yàn)，通過在切除的完整顱骨下方將熒光珠嵌入瓊脂糖中進(jìn)行成像。為了測量波前畸變，強(qiáng)光束停在最亮的區(qū)域例如熒光珠的中心，而弱光束用于掃描16×16 μm2的視野（FOV），以捕獲復(fù)雜的電場點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（PSF）。然后，通過使用測量的E場PSF的二維傅里葉變換，即可快速準(zhǔn)確地確定并有效地校正總體像差?？梢钥闯?，僅通過系統(tǒng)像差校正記錄的熒光珠圖像高度失真，旁瓣的出現(xiàn)表明由厚顱骨引起的高階像差（圖1b）。

相反，通過將校正相位模式應(yīng)用于空間光調(diào)制器（SLM）以補(bǔ)償樣品引起的像差（圖1c），有效地恢復(fù)了高成像分辨率，并將熒光強(qiáng)度提高了200倍以上（圖1b，d）。但是，衍射限制分辨率沒有完全恢復(fù)，可能是由于剩余的未校正散射引起的。在AO顯微鏡系統(tǒng)中，波前校正器通常投影到物鏡的后瞳孔平面。這種稱為瞳孔AO的配置幾乎在所有AO顯微鏡中都有實(shí)現(xiàn)。然而，瞳孔AO校正只能在非常小的FOV（<30μm直徑）上恢復(fù)聚焦質(zhì)量，如圖1e所示。為了在單AO校正的情況下獲得更大的有效成像體積，作者將共軛AO與遠(yuǎn)程聚焦相結(jié)合。使用快速電可調(diào)諧透鏡（ETL）進(jìn)行掃描，遠(yuǎn)程聚焦引起的像差被計(jì)算為系統(tǒng)像差的一部分，并在α-FSS AO校正之前由DM進(jìn)行校正。作者測量了在瓊脂糖中直徑為0.2 μm的無像差熒光珠樣品中，作為焦點(diǎn)調(diào)諧距離函數(shù)的遠(yuǎn)程聚焦的分辨率。在所有體外和體內(nèi)研究中，以實(shí)驗(yàn)測量的分辨率作為基準(zhǔn)來評估共軛α-FSS–3PM的性能。對于深度>400 μm的成像，激發(fā)光束大于SLM，導(dǎo)致分辨率降低。如圖1f、g所示，共軛AO單次校正后的有效FOV在橫向和縱向上分別擴(kuò)展至150 μm和400 μm，與瞳孔AO配置相比，校正體積增加了100倍以上。此外，由于掃描是通過遠(yuǎn)程聚焦實(shí)現(xiàn)的，無需物鏡和波前校正器的物理平移，因此可以輕松實(shí)現(xiàn)不同成像平面的快速掃描。

接下來，作者驗(yàn)證了結(jié)合α-FSS–3PM通過完整顱骨改善活體腦成像的能力。在成年Cx3Cr1 GFP小鼠的結(jié)合AO構(gòu)型中獲得了綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記的小膠質(zhì)細(xì)胞的活體圖像。使用傳統(tǒng)的3P顯微鏡（系統(tǒng)AO校正）幾乎無法識別完整顱骨下方300 μm處小膠質(zhì)細(xì)胞的詳細(xì)結(jié)構(gòu)。通過使用GFP信號的直接聚焦傳感，AO有效地補(bǔ)償了樣本誘導(dǎo)的像差，并恢復(fù)了小膠質(zhì)細(xì)胞的過程，但其有效FOV被限制在30 μm以下。相比之下，共軛AO不僅在分辨率和信號強(qiáng)度方面提供了與瞳孔AO類似的改進(jìn)，能夠清晰地分辨小膠質(zhì)細(xì)胞過程，但也能將校正后的FOV大幅放大至120 μm。此外，結(jié)合遠(yuǎn)程聚焦的AO能夠在100 μm至500 μm的成像深度上有效提高成像分辨率（圖1e–g）。

研究發(fā)現(xiàn)，盡管腦深部區(qū)域（例如490 μm處）的像差可能需要覆蓋更大顱骨區(qū)域的校正相位模式，但在300 μm處測得的校正波前仍顯示出較好的信號強(qiáng)度。簡而言之，在當(dāng)前深度測量的附加校正相位被添加到先前深度測量的相位，以生成完整AO校正的最終和最佳相位模式。這樣，可以有效地測量深度上的像差，進(jìn)一步提高信號強(qiáng)度和空間分辨率。這些結(jié)果揭示了結(jié)合α-FSS AO的巨大優(yōu)勢，該AO具有遠(yuǎn)程聚焦功能，可在大體積上通過完整顱骨對小鼠皮質(zhì)進(jìn)行活體高分辨率成像。

接下來，通過完整的顱骨對小鼠大腦皮層的神經(jīng)元和血管結(jié)構(gòu)進(jìn)行了活體成像。圖2a顯示了一只成年Thy1 YFP轉(zhuǎn)基因小鼠的皮質(zhì)，其頭骨厚度為100 μm。在這里，用單波長（1300 nm）3P激發(fā)，實(shí)現(xiàn)了YFP標(biāo)記的錐體神經(jīng)元和腦微血管的雙色熒光成像?？梢钥闯?，即使校正了系統(tǒng)像差，通過完整顱骨的3P成像中的對比度和分辨率也會隨著深度的增加而迅速降低（圖2a），這主要是因?yàn)轱B骨誘發(fā)的像差引起的激發(fā)PSF失真。因此，熒光發(fā)射水平非常低的神經(jīng)元樹突，在200 μm深度以上的完整顱骨中，常規(guī)3P成像幾乎無法觀察到。使用高靈敏度的α-FSS方法，激發(fā)光所經(jīng)歷的像差和散射都可以準(zhǔn)確確定并有效校正。通過這種方式，最佳PSF的AO恢復(fù)導(dǎo)致分辨率大大提高，信號顯著增強(qiáng)（高達(dá)40倍），使得精細(xì)結(jié)構(gòu)，如神經(jīng)元樹突，可以通過完整的顱骨清晰可見（圖2b-i）。但是，活體成像中的信號改善程度小于完整顱骨下方相同深度處熒光珠的信號改善程度。這可能是由于運(yùn)動效應(yīng)，如心跳和呼吸，將不可避免地導(dǎo)致體內(nèi)PSF測量的誤差；皮質(zhì)組織的散射也在一定程度上降低了信號的增加。有趣的是，圖2d、h中的校正相位圖案在中心區(qū)域中更平滑。這可能是因?yàn)槿肷浣禽^低的中心光線進(jìn)入樣品時，光與組織的相互作用長度較短，因此，與邊緣光線相比，其像差和散射較小。AO校正后，微血管結(jié)構(gòu)的全顱骨成像也得到了顯著改善，深度處的信號背景比（SBR）大大增加。

借助快速直接聚焦傳感，作者還將α-FSS–3PM應(yīng)用于神經(jīng)元活動的功能性鈣成像。為了使直接聚焦傳感有效工作，在熒光波動的聚焦傳感過程中，將鎖定檢測信號的輸出歸一化為熒光信號。這樣，可以消除由快速變化的鈣熒光引起的測量的E場PSF中的偽影，從而能夠準(zhǔn)確地確定像差。接下來，通過完整的顱骨對CCK-GCaMP6s轉(zhuǎn)基因小鼠皮層中的GCaMP6s標(biāo)記神經(jīng)元進(jìn)行活體鈣成像。如圖3所示，僅使用AO系統(tǒng)，樹突的鈣信號變得無法檢測，因?yàn)楸尘霸胍暨^大。通過α-FSS AO校正，來自神經(jīng)元胞體和樹突的熒光信號顯著增加，分辨率顯著提高，從而能夠記錄同步的軀體-樹突活動（圖3d，e）。此外，由于共軛AO通過遠(yuǎn)程聚焦方法提供了大的成像體積和快速的掃描，展示了通過完整顱骨的不同皮質(zhì)層的神經(jīng)元和樹突活動的近同步多平面鈣成像。

小膠質(zhì)細(xì)胞在腦內(nèi)穩(wěn)態(tài)和神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮著重要作用。具有高分辨率的非侵入性成像工具對于研究小膠質(zhì)細(xì)胞生理學(xué)至關(guān)重要。利用α-FSS-AO方法，通過對Cx3Cr1-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮層小膠質(zhì)細(xì)胞的頭骨成像進(jìn)行了體內(nèi)研究。如圖4a–c所示，共軛AO持續(xù)提高了圖像分辨率和熒光信號，使我們能夠在大成像體積上解析小膠質(zhì)細(xì)胞的精細(xì)過程，否則，如果沒有完全AO校正，就無法識別。此外，α-FSS使我們能夠通過完整的顱骨進(jìn)行精確的激光顯微手術(shù)，這是研究各種病理?xiàng)l件下的細(xì)胞機(jī)制的有力技術(shù)。多個深度的延時成像顯示，高度局限性病變僅激活少數(shù)相鄰的小膠質(zhì)細(xì)胞（在50μm的距離內(nèi)），這些小膠質(zhì)細(xì)胞以協(xié)調(diào)的方式迅速向病變延伸（圖4a）。這些結(jié)果表明，除了通過完整顱骨對大腦進(jìn)行高分辨率成像外，α-FSS在精確光學(xué)操作方面具有巨大潛力。最后，作者評估了結(jié)合α-FSS AO分別對頭骨較厚（130–140 μm）的老齡（>10個月）小鼠和頭骨機(jī)械變?。s50 μm）的小鼠進(jìn)行活體皮質(zhì)成像的能力進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，AO輔助顱骨成像方法可以促進(jìn)老齡小鼠大腦的活體研究，并且通過薄的顱骨比通過完整的顱骨獲得更好的性能。此外，還通過對阿爾茨海默?。ˋD）小鼠模型中小膠質(zhì)細(xì)胞的頭骨成像進(jìn)行了體內(nèi)研究，在該模型中，淀粉樣斑塊通過衰老在大腦中積聚，被認(rèn)為是AD病理的機(jī)制。淀粉樣斑塊周圍的小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)可以通過140 μm厚的完整顱骨清楚地分辨出來，如果沒有完全AO校正，這些是無法識別的（圖4d）。觀察到的斑塊相關(guān)小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)與之前的研究一致。

為了進(jìn)一步推進(jìn)成像深度，通過一個打開的顱骨窗口進(jìn)行了3P成像，其中一部分顱骨被一塊透明玻璃所取代，以提供直接的光學(xué)訪問大腦。在體內(nèi)對整個大腦皮層的錐體神經(jīng)元進(jìn)行成像，如圖5a所示。在這里，α-FSS導(dǎo)致3P信號顯著增加（約9倍），并恢復(fù)最深皮質(zhì)層的突觸分辨率，從而使基底樹突的單個棘清晰可見（圖5b-d）。由于厚而分散的大腦皮層所施加的限制，在不使用高侵入性程序的情況下，實(shí)現(xiàn)皮質(zhì)以外和皮質(zhì)下區(qū)域（例如海馬）的活體高分辨率成像仍然是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。先前關(guān)于海馬體內(nèi)3P成像的研究提供了細(xì)胞水平的成像分辨率。如圖5e所示，盡管在常規(guī)3P成像中可以識別海馬CA1中的神經(jīng)元胞體，但樹突結(jié)構(gòu)仍然無法清晰識別（圖5e，i）。然而，使用α-FSS AO，顯著改善了3P熒光信號，并成功恢復(fù)了突觸分辨率，使海馬CA1神經(jīng)元的頂端樹突清晰分辨（圖5e-l）。

在這項(xiàng)研究中，作者開發(fā)了一種AO 3PM技術(shù)，該技術(shù)結(jié)合了兩項(xiàng)創(chuàng)新：具有相位敏感檢測的直接聚焦傳感和具有遠(yuǎn)程聚焦的共軛AO。相位敏感檢測技術(shù)對于準(zhǔn)確測定散射和像差焦場至關(guān)重要，因此可以有效校正樣品引起的像差和散射。作者進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)，詳細(xì)比較了α-FSS中使用的鎖相檢測相位調(diào)制法和之前研究中使用的相位步進(jìn)法在電場測量中的效果。作者發(fā)現(xiàn)，采用鎖相檢測方法的相位調(diào)制的信噪比（SNR）通常高于相位步進(jìn)法，這表明相敏檢測方法在抑制噪聲方面具有優(yōu)越的性能，能夠準(zhǔn)確快速地校正樣品引起的畸變。當(dāng)相位步進(jìn)在多個周期中執(zhí)行時，α-FSS中的鎖定相位檢測和F-SHARP中的相位步進(jìn)在信號分析方面基本上是等效的。與F-SHARP不同，α-FSS可以將相敏檢測的頻率推至MHz范圍，這是由于1/F激光噪聲的優(yōu)勢。結(jié)合遠(yuǎn)程聚焦的共軛AO確保了單個校正相位模式可以在單個大成像體積上恢復(fù)高成像分辨率。使用α-FSS–3PM系統(tǒng)，通過完整的顱骨進(jìn)行了活體腦成像，這是一種理想的近乎無創(chuàng)但也極具挑戰(zhàn)性的方法。通過校正標(biāo)本引起的畸變，通過完整的顱骨實(shí)現(xiàn)了小鼠皮質(zhì)的活體高分辨率成像。由于直接聚焦感應(yīng)的速度很快，在深度顯示了密集標(biāo)記神經(jīng)元的活體功能性鈣成像，大大提高了靈敏度和準(zhǔn)確性。作者還通過完整的顱骨和小膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)的高分辨率動態(tài)成像展示了精確的激光顯微手術(shù)。我們的研究結(jié)果表明，α-FSS技術(shù)在推進(jìn)活體成像技術(shù)和促進(jìn)活體腦神經(jīng)科學(xué)研究方面具有巨大潛力。應(yīng)該注意的是，盡管紅細(xì)胞運(yùn)動產(chǎn)生的偽影會略微影響精度，直接聚焦傳感也可以通過來自血管的熒光信號來實(shí)現(xiàn)。雖然已經(jīng)證明了α-FSS-3PM在1300 nm激發(fā)下進(jìn)行腦深部成像的能力，但它可以毫無困難地應(yīng)用于1700 nm激發(fā)。理論上，對于更大的成像深度，1700 nm處的3P激發(fā)是有利的，因?yàn)槠溆行p長度更長。然而，由于最大激發(fā)功率不應(yīng)超過100 mW以避免組織損傷，由于3P激發(fā)效率低，成像深度受到大腦深層微弱信號的限制。據(jù)報道，量子點(diǎn)的3P激發(fā)截面比傳統(tǒng)熒光染料的3P激發(fā)截面大4–5個數(shù)量級，并且能夠在高達(dá)2.1毫米的深度下對小鼠腦血管進(jìn)行3P成像。由于來自血管的3P熒光信號也可用于α-FSS，因此它可以作為腦深部區(qū)域畸變完全校正的起點(diǎn)，從而顯著增強(qiáng)用熒光標(biāo)記的細(xì)胞結(jié)構(gòu)的熒光強(qiáng)度。

教授介紹

瞿佳男博士于1983年和1986年分別獲得華中科技大學(xué)光學(xué)工程學(xué)士和碩士學(xué)位。1990年獲中國科學(xué)院上海光學(xué)精密機(jī)械研究所光學(xué)博士學(xué)位。此后，他在加州大學(xué)歐文分校物理系工作了一年，并在不列顛哥倫比亞癌癥研究中心擔(dān)任博士后研究員兩年多。瞿博士現(xiàn)為香港科技大學(xué)電子及計(jì)算機(jī)工程系教授。瞿博士是美國光學(xué)學(xué)會（OSA）和國際光學(xué)與光子學(xué)學(xué)會（SPIE）的當(dāng)選會員。他是《光學(xué)快報》和《生物醫(yī)學(xué)光學(xué)雜志》的專題編輯和編輯委員會成員。他的研究目標(biāo)是為醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)中的問題提供工程解決方案。這一研究方向涵蓋了應(yīng)用于醫(yī)學(xué)成像、生物醫(yī)學(xué)光學(xué)和生物光子學(xué)、神經(jīng)工程、醫(yī)學(xué)電子學(xué)、生物信息學(xué)/計(jì)算生物學(xué)、生物信號處理、生物醫(yī)學(xué)微器件和生物醫(yī)學(xué)材料的工程原理和材料技術(shù)。

參考文獻(xiàn)

Qin Z, She Z, Chen C, et al. Deep tissue multi-photon imaging using adaptive optics with direct focus sensing and shaping. Nat Biotechnol. 2022;10.1038/s41587-022-01343-w. doi:10.1038/s41587-022-01343-w