lane： 測序反應(yīng)的平行泳道，其內(nèi)表面是做了專門的化學(xué)修飾（共價(jià)鍵連接）的（將2種DNA引物種在玻璃表面，與測序的接頭序列相互補(bǔ)），試劑添加、洗脫等過程的發(fā)生位置

flowcell微觀結(jié)構(gòu)

DNA引物種在玻璃表面，與測序的接頭序列相互補(bǔ)

DNA引物通過共價(jià)鍵在玻璃表面，與測序的接頭序列相互補(bǔ)

雙端測序： 可能序列比較長有四五百bp，兩邊各測120-150bp

junction： 雙端測序中間一些沒有測到的區(qū)域

index(barcode)：一個(gè)lane通常要測多個(gè)樣品，每個(gè)樣品都加上特定的序列標(biāo)簽，用于區(qū)分不同樣品。

flowcell構(gòu)造：一個(gè)lane包含兩列（swath），每一列有60個(gè)tile，每個(gè)tile會(huì)種下不同的cluster，每個(gè)tile在一次循環(huán)中會(huì)拍照4次（每個(gè)堿基一次）

2.1.2 文庫構(gòu)建

1.超聲斷裂

DNA超聲斷裂成小的片段

2. 平末端

打斷以后會(huì)出現(xiàn)末端不平整的情況，用酶補(bǔ)平，所以現(xiàn)在的序列是。

3. 3’ 端加A 尾（Klenow酶）

4. 連接酶連接特定接頭

文庫構(gòu)建完成 Library

2.1.3 橋式PCR

將已經(jīng)構(gòu)建好的文庫，種到芯片上去，然后進(jìn)行擴(kuò)增的一個(gè)過程

1.加入DNA文庫，形成與芯片引物結(jié)合狀態(tài)

2.加入d NTP和聚合酶，合成新的DNA

3.加入NaOH溶液。解離DNA雙鏈

4. 沒有和芯片共價(jià)（原來的鏈）的DNA單鏈解離沖走

5. 加入中性溶液，形成橋接

互補(bǔ)鏈的p7‘和lane上的p7互補(bǔ)（但還是一個(gè)lane中的）就像下圖這樣（摘自illumina官網(wǎng)）目的是快速擴(kuò)增lane p7接頭連接的鏈，也就是下圖中的Forward Strand，它和我們的模版鏈?zhǔn)且恢碌摹Ｎ覀兒髞頊y序只用這一半。

6. 加入dNTP和聚合酶，形成橋狀DNA

7. 加入NaOH溶液，解離DNA

8. 重復(fù)加入中和液，NaOH，形成cluster

cluster

9. 解鏈：?

橋式PCR完成后，形成了很多的橋形的互補(bǔ)雙鏈，再次強(qiáng)堿解鏈。這一次不再進(jìn)行復(fù)制，而是利用一種酶--甲酰胺基嘧啶糖苷酶（Fpg）選擇性的切掉lane 上p5‘ 連接的鏈，只留下了與lane p7連接的鏈即Forward Strand。

Forward Strand

2.1.4 目標(biāo) RNA 測序

特殊的dNTP的3‘ 羥基被疊氮基團(tuán)替代

測序流程

1.先是primer結(jié)合到靠近p5的sequencing primer binding site1上，再加入特殊的dNTP【它的3‘ 羥基被疊氮基團(tuán)替代，因此每次只能添加一個(gè)dNTP；還含有熒光基團(tuán)，能激發(fā)不同顏色】；

2.在dNTP被添加到合成鏈上后，所有未使用的游離dNTP和DNA聚合酶會(huì)被洗脫掉；再加入激發(fā)熒光緩沖液，用激光激發(fā)熒光信號(hào)，光學(xué)設(shè)備記錄熒光信號(hào)的記錄，計(jì)算機(jī)將光學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)化為測序堿基，這一個(gè)循環(huán)就能測定flowcell上成千上萬的cluster，這就實(shí)現(xiàn)了高通量。

3.再加入化學(xué)試劑淬滅熒光信號(hào)并使dNTP 3’ 疊氮基團(tuán)變成羥基，這樣能繼續(xù)向下進(jìn)行再加一個(gè)，并且保證這個(gè)不再發(fā)出熒光。如此重復(fù)直至所有鏈的堿基序列被檢測出。得到了Forward Strand序列。

4.因?yàn)橐粋€(gè)cluster的序列是一樣的，所以理論上cluster的熒光顏色應(yīng)該一致。

2.1.5 index測序

上面的循環(huán)結(jié)束后，read product被沖掉，index1 primer和鏈上的index1 互補(bǔ)配對(duì)，進(jìn)行index1的檢測。測完后，洗脫產(chǎn)物，得到index1 的序列。接下來p5與lane上的p5‘配對(duì)，測得了index2，并洗脫。

2.1.6??雙端測序之Reverse Strand

洗脫掉index2 產(chǎn)物后，還是一個(gè)橋式擴(kuò)增，得到雙鏈，再變性得到原始Forward strand 和 新的Reverse Strand， 除去測完的Forward strand。然后和測Forward一樣，也是先連接primer，只是連接的位點(diǎn)是Primer Binding Site2，測完后得到reverse strand序列。

Forward strand 用酶切除

Reverse Strand 測序

思考？
為什么Illumina測序會(huì)有長度限制呢？

1.測序時(shí)，經(jīng)過長時(shí)間的PCR，會(huì)有不同步的情況。通俗一點(diǎn)講，比如一開始1個(gè)cluster中是100個(gè)完全一樣的DNA鏈，但是經(jīng)過1輪增加堿基，其中99個(gè)都加入了1個(gè)堿基，顯示了紅色，另外1個(gè)沒有加入堿基，不顯示顏色。這時(shí)候整體為紅色，我們可以順利得到結(jié)果。隨后，在第2輪再加入堿基進(jìn)行合成的時(shí)候，就變成了，之前沒有加入的加入了1個(gè)堿基顯示紅色，剩下的99個(gè)顯示綠色，這個(gè)時(shí)候就會(huì)出現(xiàn)雜信號(hào)。當(dāng)測序長度不斷延長，這個(gè)雜信號(hào)會(huì)越來越多，最后很有可能出現(xiàn)，50個(gè)紅，50個(gè)綠色，這時(shí)候我們判斷不出來到底是什么堿基被合成。

2.測序過程中，使用的堿基是特殊處理的，有一個(gè)非常大的熒光基團(tuán)修飾。在使用DNA ploymerase的時(shí)候，酶的狀態(tài)也會(huì)受到底物的影響，越來越差。

數(shù)據(jù)產(chǎn)生??

Hiseq2000測序儀

測序儀搭配了兩個(gè)flowcell，簡稱雙流動(dòng)槽。比較經(jīng)典的Hiseq2500一次能產(chǎn)出700-800Gb數(shù)據(jù)（此處Gb為測序堿基數(shù)，不同于字節(jié)數(shù)的Gb）

數(shù)據(jù)量=單端reads長度 * 單端reads個(gè)數(shù) * 2（PE)

測序深度=數(shù)據(jù)量大小/ 參考基因組大小

參考資料：【陳巍學(xué)基因】視頻25：第一代DNA測序_嗶哩嗶哩_bilibili

參考資料：測序原理：一代二代三代測序原理詳解 - 簡書