前段時間做了核漿蛋白分別提取跑western的實驗，不聽說明書的勸，瞎踩了很多雷。在此記錄下來，告誡自己不要亂來。
實驗過程中使用的是弗德的核漿蛋白分離提取試劑盒。沒有試過其他牌子的，所以不做比較。但是特別喜歡弗德的技術(shù)老師，每次遇到麻煩咨詢問題，技術(shù)老師都能花上半小時到一個小時的時間各種科普，還很擅長舉例子省得你聽不懂。
首先附上核漿蛋白分離提取的原理：一般是先利用低濃度的鹽，在低滲透壓條件下，使細胞充分膨脹，然后破壞細胞膜，釋放出細胞漿蛋白；然后使用含有SDS的bufferB通過增加蛋白的溶解度，獲得胞漿蛋白；接著用高鹽溶液提取核蛋白。
大致步驟（以一個10 cm 皿的細胞為例）：
1. 收集細胞沉淀（建議用2mL尖底EP管，方便吸干凈上清），按照說明書提示加入1 mL胞漿蛋白裂解液A（細胞只有單層的情況下加500 uL裂解液），槍頭吹打混勻后放于冰上靜置20-30分鐘。
2. 按比例加入buffer B，槍頭輕輕吹打混勻靜置一分鐘后離心（不建議渦旋混勻，控制不好力度的情況下容易導致胞核蛋白溢出）
3. 輕輕吸取200 uL 上清，剩余上清棄去（注意避開沉淀吸干凈上清）。視情況加入100-200 uL裂解液c（可以用中強度RIPA代替）。此后步驟沒啥好說的。
總的來說，關(guān)鍵就是用尖底EP管，加入bufferB后不要渦旋。
