關(guān)鍵詞：IOPD；基因編輯技術(shù)；生信分析服務(wù)；

文獻(xiàn)介紹

標(biāo)題（英文）：CRISPR-Cas9 generated Pompe knock-in murine model exhibits early-onset hypertrophic cardiomyopathy and skeletal muscle weakness

標(biāo)題（中文）：CRISPR-Cas9 生成的龐貝敲入小鼠模型表現(xiàn)出早發(fā)性肥厚型心肌病和骨骼肌無(wú)力

發(fā)表期刊：scientific reports

作者單位：加州大學(xué)圣地亞哥分校等

發(fā)表年份：2020

文章地址：https://doi.org/10.1038/s41598-020-65259-8

圖1? 文獻(xiàn)介紹

嬰兒型龐貝病(IOPD)由溶酶體酸性α-葡萄糖苷酶(Gaa)基因突變引起，表現(xiàn)為進(jìn)展迅速的致命性心臟和骨骼肌病，靜脈輸注合成GAA治療效果不完全。目前可用的小鼠模型僅表現(xiàn)為骨骼肌病和晚發(fā)性肥厚型心肌病，尚未能完全模擬人類IOPD。

因此，研究團(tuán)隊(duì)想通過(guò)CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)來(lái)構(gòu)建更接近人類的IOPD模型。使用C2C12細(xì)胞系和不同基因型的小鼠模型作為研究樣本，包括8只通過(guò)同系繁殖的野生型(WT)、12只G1代雜交的雜合子(HET)、5只G2代自交的純合子(KI)、以及3只作為對(duì)照組，已有Gaa tm1Rabn/J小鼠(KO)。研究采用創(chuàng)新性的雙sgRNA策略實(shí)現(xiàn)了Gaa基因c.1826位點(diǎn)的精準(zhǔn)編輯，并通過(guò)分子生物學(xué)表征、生化分析、功能評(píng)估和病理學(xué)觀察等多維度方法進(jìn)行了全面驗(yàn)證。

測(cè)序流程

在基因數(shù)據(jù)分析過(guò)程中，研究團(tuán)隊(duì)使用Sentieon進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理、去除重復(fù)序列、對(duì)插入和缺失位點(diǎn)進(jìn)行重新比對(duì)、并使用GVCFtyper進(jìn)行SNV檢測(cè)；

圖2? Sentieon的作用

Sentieon提供一站式定制化的基因組數(shù)據(jù)分析服務(wù)，涵蓋從比對(duì)到變異檢測(cè)全流程；Sentieon高度優(yōu)化的算法和企業(yè)級(jí)的軟件工程，能夠顯著提升NGS數(shù)據(jù)處理的效率、準(zhǔn)確性和可靠性。Sentieon與開(kāi)源軟件結(jié)果一致性達(dá)到99%以上的同時(shí)，在速度和精準(zhǔn)度方面都優(yōu)于開(kāi)源，能更快更精確地將變異檢測(cè)結(jié)果交付到您的手上。

雙sgRNA策略在C2C12細(xì)胞中達(dá)到41.0%的靶向編輯活性和12.6%的HDR效率，顯著優(yōu)于單一sgRNA策略。構(gòu)建的Gaac.1826dupA敲入C2C12細(xì)胞系表現(xiàn)出GAA轉(zhuǎn)錄本水平降低96%，酶活性完全缺失，并出現(xiàn)明顯的糖原積累。

圖3? Gaac.1826dupA C2C12克隆細(xì)胞系的構(gòu)建(A) 靶向Gaac.1826位點(diǎn)的引導(dǎo)RNA序列。(B) 對(duì)照(Gaawt)和克隆敲入(Gaac.1826dupA) C2C12肌母細(xì)胞基因組DNA在Gaac.1826位點(diǎn)的Sanger測(cè)序圖譜。(C) 對(duì)照(Gaawt)和克隆敲入(Gaac.1826dupA) C2C12肌母細(xì)胞的過(guò)碘酸-雪夫氏(PAS)染色。(D) (左圖)Gaawt和Gaac.1826dupA C2C12肌母細(xì)胞中的Gaa mRNA表達(dá)。(右圖)Gaawt和Gaac.1826dupA C2C12肌母細(xì)胞中的GAA酶活性。

該策略應(yīng)用于小鼠胚胎獲得了66.7%的靶向編輯活性和25%的HDR效率。全基因組測(cè)序顯示G0創(chuàng)始小鼠中Gaac.1826dupA突變的整合率為63%，未檢測(cè)到明顯脫靶。經(jīng)過(guò)兩代育種獲得純合Gaac.1826dupA敲入小鼠。

圖4? Gaac.1826dupA敲入轉(zhuǎn)基因小鼠系的構(gòu)建(A) 靶向Gaac.1826位點(diǎn)的雙重重疊引導(dǎo)RNA方法。箭頭方向表示引導(dǎo)RNA是正義(右)還是反義(左)。原間隔基序(PAM; NGG)以與引導(dǎo)RNA箭頭相對(duì)應(yīng)的顏色突出顯示。(B) 用于Gaac.1826dupA敲入突變靶向整合的單鏈供體寡核苷酸(ssODN)序列。(C) 從嵌合CRISPR生成的創(chuàng)始小鼠分離Gaac.1826dupA敲入等位基因以產(chǎn)生純合Gaac.1826dupA敲入小鼠的交配方案譜系圖。(D) 對(duì)照(Gaawt)、創(chuàng)始(GaaMosaic)、雜合(Gaawt/c.1826dupA)和純合敲入(Gaac.1826dupA)小鼠的測(cè)序圖譜。(E) G0創(chuàng)始(GaaMosaic)和G1雜合(Gaawt/c.1826dupA)小鼠Gaac.1826位點(diǎn)的WGS靶向分析。(F) 用于WGS脫靶篩選的與Gaac.1826 gRNA-2&3最相似的5個(gè)脫靶序列列表。

轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出顯著的分子和生化改變：KI小鼠Gaa轉(zhuǎn)錄本水平較野生型降低75%，心臟、橫膈膜和腓腸肌的GAA酶活性分別降低97%、96%和98%。這些組織中糖原含量分別增加185倍、108倍和28倍。自噬標(biāo)志物L(fēng)C3B-I在心臟和腓腸肌分別增加2.3倍和3.6倍，LC3B-II增加3.2倍和4.8倍。

圖5? Gaac.1826dupA敲入小鼠顯示GAA表達(dá)和酶活性降低(A) 3周齡Gaawt(WT)、Gaawt/c.1826dupA(HET)、Gaac.1826dupA(KI)和Gaatm1Rabn(KO)小鼠尾部活檢中的Gaa mRNA表達(dá)。(B) 各基因型小鼠心臟、橫膈膜和腓腸肌中的GAA酶活性。(C) 使用比色法測(cè)定各組小鼠心臟、橫膈膜和腓腸肌中的糖原水平。

圖6? Gaac.1826dupA敲入小鼠表現(xiàn)出自噬障礙的標(biāo)志物(A)LC3B-I和(B)LC3B-II在以下小鼠的心臟、橫膈膜和腓腸肌中的蛋白表達(dá):Gaawt(WT, n=4)、Gaawt/c.1826dupA(HET, n=4)、Gaac.1826dupA(KI, n=4)、Gaatm1Rabn(KO, n=3)數(shù)據(jù)以相對(duì)于WT表達(dá)的倍數(shù)差異報(bào)告,來(lái)自兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)分析采用單向ANOVA和Tukey事后檢驗(yàn)(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001)。(C)各組小鼠心臟、橫膈膜和腓腸肌中LC3B-II與總LC3B的比值,數(shù)據(jù)來(lái)自兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)分析同上(*p<0.05, **p<0.01)。

KI小鼠出現(xiàn)心肌病變和肌無(wú)力癥狀，超聲心動(dòng)圖顯示心室間隔增厚，左心室功能異常。組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)心臟和骨骼肌中存在大量PAS陽(yáng)性物質(zhì)沉積，肌纖維結(jié)構(gòu)異常。這些特征與人類龐貝病的臨床表現(xiàn)高度一致，驗(yàn)證了該模型在治療策略評(píng)估中的應(yīng)用價(jià)值。

圖7? Gaac.1826dupA敲入小鼠顯示左心室肥厚的解剖特征(A)3月齡WT、HET和KI小鼠的代表性超聲心動(dòng)圖。黃色箭頭示室間隔直徑(IVSd),紅色箭頭示左心室后壁直徑(LVPWd)。(B)3月齡小鼠測(cè)量結(jié)果:Gaawt(WT, n=27)、Gaawt/c.1826dupA(HET, n=12)、Gaac.1826dupA(KI, n=13)相比WT和HET小鼠,KI小鼠的IVSd、LVPWd和LV質(zhì)量指數(shù)顯著增加,這些都是左心室肥厚的解剖學(xué)標(biāo)志。統(tǒng)計(jì)分析采用單向ANOVA和Tukey事后檢驗(yàn)(*p<0.05, ****p<0.0001)。

圖8? Gaac.1826dupA敲入小鼠心臟和骨骼肌中顯示異常糖原累積展示3月齡WT和KI小鼠經(jīng)PAS染色和蘇木精復(fù)染的固定組織切片代表性圖像。組織經(jīng)4% PFA心臟灌注后收集,心臟和橫膈膜橫切,腓腸肌縱切。使用EVOS M5000成像系統(tǒng)在20倍物鏡下以RGB模式拍攝。箭頭指示糖原累積區(qū)域。

Sentieon 軟件團(tuán)隊(duì)擁有豐富的軟件開(kāi)發(fā)及算法優(yōu)化工程經(jīng)驗(yàn)，致力于解決生物數(shù)據(jù)分析中的速度與準(zhǔn)確度瓶頸，為來(lái)自于分子診斷、藥物研發(fā)、臨床醫(yī)療、人群隊(duì)列、動(dòng)植物等多個(gè)領(lǐng)域的合作伙伴提供高效精準(zhǔn)的軟件解決方案，共同推動(dòng)基因技術(shù)的發(fā)展。

截至 2023 年 3 月份，Sentieon 已經(jīng)在全球范圍內(nèi)為 1300+用戶提供服務(wù)，被世界一級(jí)影響因子刊物如 NEJM、Cell、Nature 等廣泛引用，引用次數(shù)超過(guò) 700 篇。此外，Sentieon 連續(xù)數(shù)年摘得了 Precision FDA、Dream Challenges 等多個(gè)權(quán)威評(píng)比的桂冠，在業(yè)內(nèi)獲得廣泛認(rèn)可。

文獻(xiàn)討論

圖9? 文獻(xiàn)討論

新開(kāi)發(fā)的Gaac.1826dupA KI小鼠模型攜帶與人類IOPD患者同源的Gaa突變，這使其在基因型上更接近人類疾病特征。相比之下，舊的Gaatm1Rabn/J KO小鼠模型并不具備這種遺傳同源性，限制了其在基因組靶向治療研究中的應(yīng)用。

在疾病進(jìn)展上，新模型展現(xiàn)出更早期的表型特征，特別是在3個(gè)月齡時(shí)就能觀察到心臟肥大的現(xiàn)象。而舊模型需要等到約8個(gè)月齡時(shí)才能觀察到類似癥狀，這種延遲限制了其在早期干預(yù)研究中的應(yīng)用價(jià)值。從臨床應(yīng)用角度來(lái)看，新模型更適合用于評(píng)估基因組校正和靶向治療策略。

但研究?jī)H關(guān)注單一突變位點(diǎn)和短期表型分析，缺乏對(duì)疾病進(jìn)展的長(zhǎng)期觀察和深入的分子機(jī)制探討。

總結(jié)

研究首次利用CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建攜帶與人類致病突變同源（Gaa c.1826dupA）的龐貝病小鼠模型，更精準(zhǔn)模擬人類IOPD的病理特征，為疾病機(jī)制研究和個(gè)性化治療策略開(kāi)發(fā)提供了重要工具。