酵母三雜交（Yeast Three-Hybrid, Y3H）是在酵母雙雜交（Y2H）基礎(chǔ)上發(fā)展的體外高通量篩選技術(shù)，主要就是應(yīng)用于研究三元間的復(fù)雜互作情況，簡言之該技術(shù)就是在酵母雙雜基礎(chǔ)上加一個(gè)“中間搭橋分子”，讓本來不直接互作的兩個(gè)蛋白，靠第三者拉到一起，從而激活報(bào)告基因?！綯ips: 酵母三雜交=BD+AD+中間分子（RNA、小分子、第三個(gè)蛋白）】

酵母三雜交技術(shù)原理圖

【文獻(xiàn)應(yīng)用】

2025年2月，武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院胡駿教授團(tuán)隊(duì)文章（IF=10.4）。

前期證明OsBURP3 與 OsSUS1可在細(xì)胞核內(nèi)直接互作，且需要 OsBURP3 全長蛋白。為明確三者的互作層級(jí)，采用酵母三雜系統(tǒng)來體現(xiàn)，圖f（酵母三雜交） 包含兩組核心對比實(shí)驗(yàn)：

組別 1：pGADT7-OsBURP3 + pBridge-SLR1 (MCSI)-OsSUS1 (MCSII)

SLR1 插入MCSI（組成型表達(dá)，不受 Met 調(diào)控），OsSUS1 插入MCSII（Met 調(diào)控型表達(dá)，無 Met 時(shí)表達(dá)）；結(jié)論：在酵母中經(jīng)甲硫氨酸（Met）誘導(dǎo) OsSUS1 表達(dá)時(shí)，OsBURP3 可與 SLR1 發(fā)生相互作用

組別2：pGADT7-OsBURP3 + pBridge-OsSUS1(MCSI)-SLR1(MCSII)

OsSUS1 插入MCSI（組成型表達(dá)，不受 Met 調(diào)控），SLR1 插入MCSII（Met 調(diào)控型表達(dá)，無 Met 時(shí)表達(dá)）；結(jié)論：經(jīng)甲硫氨酸誘導(dǎo) SLR1 表達(dá)時(shí)，OsBURP3 則無法與 OsSUS1 產(chǎn)生相互作用。

該酵母三雜結(jié)果直接證實(shí)了 SLR1 對 OsBURP3-OsSUS1 互作的競爭性抑制作用，即SLR1 通過競爭性結(jié)合 OsBURP3，特異性阻斷 OsBURP3 與 OsSUS1 的核內(nèi)互作。

圖（部分）：水稻 SLR1 蛋白與OsSUS1蛋白競爭性結(jié)合 OsBURP3 蛋白

【小源科普-“酵母三雜交”常見實(shí)驗(yàn)問題】

1、酵母生長狀態(tài)異常情況

a. 共轉(zhuǎn)化后酵母菌落過小、生長緩慢，甚至無法形成菌落？

核心原因：融合蛋白在酵母中表達(dá)產(chǎn)生細(xì)胞毒性，抑制酵母增殖。

解決方法：檢測蛋白毒性，將單個(gè)融合載體轉(zhuǎn)化酵母，在全營養(yǎng)培養(yǎng)基（YPD）上觀察生長，若生長緩慢則為蛋白毒性，需截短蛋白或更換載體。

b.?不同實(shí)驗(yàn)組的酵母生長密度差異極大，無法對比？

核心原因：培養(yǎng)條件不當(dāng)（溫度過高/過低，Y3H 適宜 28℃，高于 30℃會(huì)抑制報(bào)告基因表達(dá)）

解決方法：規(guī)范培養(yǎng)條件，28℃恒溫培養(yǎng)，避免溫度波動(dòng)，培養(yǎng)時(shí)間控制在3-5天（過長易出現(xiàn)雜菌）。

2、第三分子的表達(dá)調(diào)控問題

a. 誘導(dǎo)型表達(dá)失效，如 Met 誘導(dǎo)的 pBridge 載體，誘導(dǎo)后第三分子仍未表達(dá)？

核心原因：pBridge 載體的多克隆位點(diǎn)酶切位點(diǎn)選擇不當(dāng)，導(dǎo)致基因插入方向錯(cuò)誤。

解決方法：驗(yàn)證插入方向和序列，通過菌落 PCR、測序確認(rèn)基因在 MCSI/MCSII 的插入方向正確，無移碼突變。

b. 組成型表達(dá)過強(qiáng)/過弱：MCSI 的組成型啟動(dòng)子表達(dá)量過高導(dǎo)致毒性，或過低無法介導(dǎo)互作？

核心原因：誘導(dǎo)物（Met）濃度過高/過低，或選用的酵母菌株對誘導(dǎo)物不敏感。

解決方法：優(yōu)化誘導(dǎo)條件，Met 誘導(dǎo)濃度設(shè) 0.05、0.1、0.5、1 mM 梯度，28℃培養(yǎng)24-48 h后檢測表達(dá)。