Trizol 提取RNA的步驟和注意事項(xiàng)
提取原理
Trizol可以破壞細(xì)胞使RNA釋放出來(lái)的同時(shí)，同時(shí)使RNA酶變性失活，保護(hù)RNA的完整性。Trizol的主要成分為異硫氰酸胍、酚和B-巰基乙醇，異硫氰酸胍屬于解偶劑，是一類強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑，可溶解蛋白質(zhì)，并使蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞結(jié)構(gòu)降解，核蛋白迅速與核酸分離。
提取中加入氯仿，主要用處是用來(lái)分相，加速有機(jī)相和水相的分層，上層為水相，PH 5.1左右，只有RNA分子留在水相，DNA分子沉淀在酚與溶液的界面。加入異丙醇，主要沉淀大分子rRNA和mRNA。最后加入乙醇主要是洗滌異丙醇，也可以溶解一部分蛋白，去除雜質(zhì)。
提取RNA純度的判斷
判斷RNA 的質(zhì)量主要有兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，一是完整性（是否被降解），二是純度。RNA的完整性主要通過(guò)電泳分析來(lái)闡明，未降解的總RNA電泳時(shí)在凝膠中會(huì)出現(xiàn)28S、18S和5S rRNA對(duì)應(yīng)的條帶，如果有DNA污染則在RNA后會(huì)發(fā)現(xiàn)基因組DNA對(duì)應(yīng)的條帶。
完整性的圖片大致如下圖所示：
RNA的純度可以通過(guò)分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定的A260／A280值來(lái)判斷。蛋白中trp、tyr、phe的吸光度為280nm，所以280nm常用來(lái)表示蛋白質(zhì)吸光度；而260nm為DNA的吸光度。
理論上，純的RNA情況下：OD260/OD280的值為2，純的DNA情況下：OD260/OD280的值為1.8.
OD260反映的是溶液中核酸的濃度，OD280反映的是溶液中蛋白質(zhì)或者氨基酸的濃度。
樣品中如果含有蛋白質(zhì)及苯酚，A260/A280比值會(huì)明顯下降。對(duì)于純的樣品只要讀出260 nm 的A值即可以算出含量。通常以A值為1相當(dāng)于50微克/ml 雙螺旋DNA，或者40微克/ml 單鏈DNA（RNA），或者20微克/ml 寡核苷酸計(jì)算。
OD260/OD280=1.9~2.0 RNA居多，純度已經(jīng)很高了。
純DNA：OD260/OD280≈1.8(>1.9，表明有RNA污染；<1.6，表明有蛋白質(zhì)、酚等污染）
純RNA：1.9 <OD260/OD280<2.0（2.0時(shí)表明可能有異硫氰酸殘存）
提取步驟
提取前需要準(zhǔn)備：
75%的乙醇（提前于-20冰箱保存）、氯仿、RNAase-free water、1.5ml Eppendorf離心管、Tips（RNAase-free）。
需要特別注意的是一定要帶好手套和口罩，做好個(gè)人防護(hù)工作?。?！并且也可以防止RNA降解
步驟：
（1） 培養(yǎng)細(xì)胞： 收獲細(xì)胞1-5×107，移入1.5ml離心管中，加入1ml Trizol，混勻，室溫靜置5min。
（2） 組織：取50-100mg組織（新鮮或-70℃及液氮中保存的組織均可）置1.5ml離心管中，加入0.8~1ml Trizol充分勻漿，室溫靜置５min。
（3）按200ul氯仿/ ml Trizol的量加入氯仿，劇烈震蕩15s，室溫放置3min。注：劇烈震蕩使基因組DNA斷裂。
（4）4℃離心，12000rpm，15min。注：離心后分為三層，下層為紅色的苯酚—氯仿層，中間層和上層的水樣層，RNA存在于水樣層中。若只提RNA，千萬(wàn)不要吸取中間層和下層酚—酚相，可保存于4℃冰箱。
（5）將上層水相轉(zhuǎn)移至另一個(gè)EP管中，加入等體積的異丙醇并混勻(約500ul)，室溫放置10min或者-20冰箱沉淀2h，也可以-20冰箱沉淀過(guò)夜。
（6）4℃離心，12000 rpm，10min，用槍頭小心吸走液體，RNA沉于管底。
（7）用0.5ml 75%冰乙醇洗滌RNA沉淀，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。
（8）4℃離心，8,000rpm，5min。重復(fù)兩次。棄去乙醇后，室溫干燥RNA沉淀5-10min。
（9）可用50ul H2O溶解RNA樣品，55-60℃ 溶解5-10min，保存于-80℃。
所得RNA可以繼續(xù)用于下游實(shí)驗(yàn)。
