前言實際的科研項目中不可能只有一個樣本，多樣本的單細胞數(shù)據(jù)如何合并在一起，是否需要校正批次效應呢？先上一張圖說明多樣本scRNA數(shù)據(jù)的批次效應：

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左邊的圖簡單地把多個單細胞的數(shù)據(jù)合并在一起，不考慮去除批次效應，樣本之間有明顯的分離現(xiàn)象。右邊的圖是使用算法校正批次效應，不同的樣本基本融和在一起了。scRNA數(shù)據(jù)校正批次效應的算法有很多：MNN, CCA+MNN, Harmony, Scanorama, scMerge等，本文推薦發(fā)表在Cell上的CCA+MNN方法，通過Seurat包就可以實現(xiàn)。Seurat數(shù)據(jù)整合功能簡介Seurat早期版本整合數(shù)據(jù)的核心算法是CCA，文章發(fā)表在2018年的nature biotechnology，作者是Seurat的開發(fā)者Andrew Butler。同年Haghverdi等人開發(fā)了MNN算法校正批次效應，文章也發(fā)表在了nature biotechnology。2019年Andrew等人將CCA與MNN算法結(jié)合起來，并參考SNN算法的理念設計了“錨點”評分體系，使Seurat整合數(shù)據(jù)更強大更穩(wěn)健。它不僅可以校正實驗的批次效應，還能跨平臺整合數(shù)據(jù)，例如將10x單細胞數(shù)據(jù)、BD單細胞數(shù)據(jù)和SMART單細胞數(shù)據(jù)整合在一起；也能整合單細胞多組學數(shù)據(jù)，例如將單細胞ATAC、空間轉(zhuǎn)錄組與單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)整合在一起。本文只討論多樣本數(shù)據(jù)的合并與校正批次效應，多組學數(shù)據(jù)的整合以后專門寫篇文章介紹。Seurat整合流程與原理

1、使用CCA分析將兩個數(shù)據(jù)集降維到同一個低維空間，因為CCA降維之后的空間距離不是相似性而是相關性，所以相同類型與狀態(tài)的細胞可以克服技術偏倚重疊在一起。CCA分析效果見下圖：

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左圖使用PCA降維，細胞之間的距離體現(xiàn)的是轉(zhuǎn)錄特征相似性，批次效應引入的系統(tǒng)誤差會使樣本分離。右圖使用CCA降維，細胞之間的距離體現(xiàn)的是轉(zhuǎn)錄特征相關性，因此同類型且同狀態(tài)的細胞可以跨越技術差異重疊在一起。

2、CCA降維之后細胞在低維空間有了可以度量的“距離”，MNN(mutual nearest neighbor)算法以此找到兩個數(shù)據(jù)集之間互相“距離”最近的細胞，Seurat將這些相互最近鄰細胞稱為“錨點細胞”。我們用兩個數(shù)據(jù)集A和B來說明錨點，假設：

• A樣本中的細胞A3與B樣本中距離最近的細胞有3個（B1,B2,B3）

• B樣本中的細胞B1與A樣本中距離最近的細胞有4個（A1,A2,A3,A4）

• B樣本中的細胞B2與A樣本中距離最近的細胞有2個（A5,A6）

• B樣本中的細胞B3與A樣本中距離最近的細胞有3個（A1,A2,A7）

那么A3與B1是相互最近鄰細胞，A3與B2、B3不是相互最近鄰細胞，A3+B1就是A、B兩個數(shù)據(jù)集中的錨點之一。實際數(shù)據(jù)中，兩個數(shù)據(jù)集之間的錨點可能有幾百上千個，如下圖所示：

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圖中每條線段連接的都是相互最近鄰細胞

3、理想情況下相同類型和狀態(tài)的細胞才能構(gòu)成配對錨點細胞，但是異常的情況也會出現(xiàn)，如上圖中query數(shù)據(jù)集中黑色的細胞團。它在reference數(shù)據(jù)集沒有相同類型的細胞，但是它也找到了錨點配對細胞（紅色連線）。Seurat會通過兩步過濾這些不正確的錨點：

1. 在CCA低維空間找到的錨點，返回到基因表達數(shù)據(jù)構(gòu)建的高維空間中驗證，如果它們的轉(zhuǎn)錄特征相似性高則保留，否則過濾此錨點。

2. 檢查錨點細胞所在數(shù)據(jù)集最鄰近的30個細胞，查看它們重疊的錨點配對細胞的數(shù)量，重疊越多分值越高，代表錨點可靠性更高。原理見下圖：

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左邊query數(shù)據(jù)集的一個錨點細胞能在reference數(shù)據(jù)集鄰近區(qū)域找到多個配對錨點細胞，可以得到更高的錨點可靠性評分；右邊一個錨點細胞只能在reference數(shù)據(jù)集鄰近區(qū)域找到一個配對錨點細胞，錨點可靠性評分則較低。

4、經(jīng)過層層過濾剩下的錨點細胞對，可以認為它們是相同類型和狀態(tài)的細胞，它們之間的基因表達差異是技術偏倚引起的。Seurat計算它們的差異向量，然后用此向量校正這個錨點錨定的細胞子集的基因表達值。校正后的基因表達值即消除了技術偏倚，實現(xiàn)了兩個單細胞數(shù)據(jù)集的整合。

深究技術細節(jié)的朋友可以參閱原文：Tim S, Andrew Butler, Paul Hoffman , et al. Comprehensive integration of single cell data[J].Cell,2019.獲取數(shù)據(jù)集
本專題的數(shù)據(jù)來自Immune Landscape of Viral- and Carcinogen-Driven Head and Neck Cancer，數(shù)據(jù)集GEO編號：GSE139324。建議大家練習自己下載，也可以加Kinesin微信獲取數(shù)據(jù)的百度云鏈接。

后續(xù)我會摸索之后寫一篇下載數(shù)據(jù)的教程。

原數(shù)據(jù)集有63個scRNA的數(shù)據(jù)，都是分選的CD45+免疫細胞。考慮到計算資源問題，挑選了10個樣本用于此次演示。

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數(shù)據(jù)集合并前面講了很多數(shù)據(jù)整合的原理，大家是不是很心動呢？所有類型的單細胞數(shù)據(jù)都要進行整合嗎，數(shù)據(jù)整合算法真的像開發(fā)者說的只消除技術偏倚不掩蓋細胞之間真實的基因表達差異嗎？如果你掌握了本文介紹的內(nèi)容，建議你整合與不整合的數(shù)據(jù)都分析試試，實踐出真知！回到本節(jié)數(shù)據(jù)集合并的話題上，介紹兩種方法合并多個樣本的數(shù)據(jù)：

library(Seurat)

通過最后的dim和table函數(shù)查看數(shù)據(jù)，可以發(fā)現(xiàn)兩種方法得到的基因數(shù)和細胞數(shù)完全一樣。下面我們降維聚類看看有沒有差異：

scRNA1 <- NormalizeData(scRNA1)

第一種方法合并數(shù)據(jù)的結(jié)果：

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第二種方法合并數(shù)據(jù)的結(jié)果：

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通過降維圖可以看出兩種方法的結(jié)果完全一致。這兩種方法真的沒有一點差異嗎，有興趣的朋友可以用GSE125449的數(shù)據(jù)集試試。

數(shù)據(jù)集整合

#scRNAlist是之前代碼運行保存好的seurat對象列表，保存了10個樣本的獨立數(shù)據(jù)

與合并樣本的降維結(jié)果對比如下圖：

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數(shù)據(jù)質(zhì)控

##==數(shù)據(jù)質(zhì)控==#

質(zhì)控后的數(shù)據(jù)

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細胞類型鑒定

為了后續(xù)分析的方便，我們先用SingleR預測每個cluster的細胞類型。

##==鑒定細胞類型==##

用兩個參考數(shù)據(jù)庫分別運行SingleR，結(jié)果有一定差異，由此可見SingleR+Marker基因人工鑒定才是可靠的細胞鑒定的方法。

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我們后續(xù)分析采用左圖鑒定的結(jié)果
點擊閱讀原文單細胞轉(zhuǎn)錄組高級分析一：多樣本合并與批次校正