hello，大家好，周二了，一周最黃金的學(xué)習(xí)時間，這一篇分享的文獻(xiàn)在Comprehensive dissection of immune microenvironment in the progression of early gastric cancer at spatial and single-cell resolution，用單細(xì)胞空間的技術(shù)來表征胃癌的免疫微環(huán)境，這篇文章是國內(nèi)的學(xué)者發(fā)表的，我們來看一下單細(xì)胞空間技術(shù)的運(yùn)用與科研成果。
Abstract
雖然腫瘤免疫微環(huán)境 (TME) 的變化對大多數(shù)腫瘤進(jìn)展具有重要意義，但仍需要能夠揭示 TME 的組成和免疫特征的工作。以單細(xì)胞分辨率分析胃惡性細(xì)胞顯示轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性表現(xiàn)在胃癌的不同狀態(tài)，這意味著可能存在不同的細(xì)胞狀態(tài)，包括免疫細(xì)胞，all components in TME make some balances in early gastric cancer (EGC) progression。然而，目前尚不清楚免疫細(xì)胞如何促成惡性胃炎，構(gòu)成胃 TME 的一般特征。此外，胃 TME 中細(xì)胞間特定相互作用的作用仍有待闡明。在這里，對 18 個胃樣本進(jìn)行了空間轉(zhuǎn)錄組和單細(xì)胞 RNA-seq 分析，識別了 17 種細(xì)胞類型并重建了它們的位置信息。We found that immune cells represented different degree of dysregulations during the progression from non-atrophic gastritis (NAG), atrophic gastritis (AG) to EGC, including imbalance of cytotoxic and inhibitory effects in T cells, maturation inhibition in B cells and malignant genes up-regulated obviously in myeloid cells。此外，通路分析表明，缺氧、活性氧和脂肪代謝信號從 AG 階段開始被激活，這可能加速 EGC 的進(jìn)展。此外，細(xì)胞相互作用進(jìn)一步確定了缺氧在胃 TME 中的作用?？傮w而言，本研究中提供的多組學(xué)數(shù)據(jù)提供了從 NAG、AG 到 EGC 進(jìn)展過程中胃組織內(nèi)免疫細(xì)胞類型、狀態(tài)變化和位置的全面視圖，促進(jìn)了我們對不同胃狀態(tài)的組成和免疫的理解，為 EGC 提供診斷和預(yù)防思路（最后都是要對臨床進(jìn)行指導(dǎo)）。
Introduction
大多數(shù)腫瘤的進(jìn)展都是腫瘤細(xì)胞與其免疫微環(huán)境（包括EGC）之間動態(tài)相互作用的結(jié)果。在此過程中，胃粘膜組織出現(xiàn)異質(zhì)性變化和惡性細(xì)胞，這在以前已有報(bào)道。然而，免疫微環(huán)境如何在 EGC 進(jìn)展過程中發(fā)揮作用仍不清楚。結(jié)果表明，正常胃黏膜、simple gastritis、AG和GC的炎癥細(xì)胞浸潤、趨化因子和白細(xì)胞介素的表達(dá)存在差異。據(jù)報(bào)道，IL33促進(jìn)metaplasia，其外源性表達(dá)可中度誘導(dǎo)表達(dá)解痙多肽的metaplasia（SPEM），可能代表慢性胃炎和IM的重要關(guān)節(jié)。巨噬細(xì)胞的典型二元 M1/M2 paradigm消失了，and transcriptionally heterogenous among each cluster was in its place。此外，建立了轉(zhuǎn)移性胃腺癌 (GAC) 的 12 基因預(yù)后特征。盡管報(bào)道的工作很少，它們不足以說明從 NAG 到 EGC 的過程中的變化。
由于胃免疫微環(huán)境的復(fù)雜性和技術(shù)限制，以前很難對免疫微環(huán)境的組成、結(jié)構(gòu)和免疫進(jìn)行分析。最近開發(fā)的單細(xì)胞測序（scRNA-seq）、VDJ和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)（ST）測序已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了復(fù)雜免疫微環(huán)境的識別。作為新技術(shù)，scRNA-seq需要消化細(xì)胞懸浮，缺乏空間相對定位，而ST測序代表的是空間點(diǎn)圖像，細(xì)胞分辨率低。然后，從多組學(xué)的維度綜合運(yùn)用，不僅用scRNA-seq在單細(xì)胞分辨率下準(zhǔn)確闡明細(xì)胞生物學(xué)，而且利用ST甚至免疫文庫獲取空間位置信息和細(xì)胞間相互作用獲得 T/B 細(xì)胞。結(jié)合 scRNA-seq 和 ST 已成功闡明了幾種腫瘤和免疫微環(huán)境圖譜，包括胰腺癌、鱗狀細(xì)胞癌以及結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移。因此，考慮應(yīng)用組合方法來闡明從 NAG、AG 到 EGC 的開發(fā)過程中的微環(huán)境特征。
在這項(xiàng)研究中，獲得了 21,848 個單細(xì)胞和 11,347 個空間spot。 通過結(jié)合使用 scRNA-seq 和 ST 測序，表征了胃免疫微環(huán)境變化的失調(diào)。 多組學(xué)數(shù)據(jù)提供了從 NAG、AG 到 EGC 進(jìn)展過程中免疫細(xì)胞類型、狀態(tài)變化和胃組織內(nèi)位置的全面視圖，促進(jìn)我們對不同胃狀態(tài)的組成和免疫的理解， offering diagnostic and preventive thoughts for EGC。
Results
Exploring the spatial architecture and single cell characteristics of the immune microenvironment in the progression of EGC
為了探索胃炎向 EGC 轉(zhuǎn)化的機(jī)制，分別確定了來自 NAG、AG 和 EGC 患者的 12 個組織樣本的空間特征，這些樣本代表了胃癌發(fā)展的不同階段。識別出可區(qū)分的腫瘤區(qū)域、有或沒有 IM 的萎縮區(qū)域以及沒有明顯病變的區(qū)域。這些區(qū)域的相關(guān)性分析表明，各組的非病變區(qū)域之間存在差異，更不用說可區(qū)分的病變區(qū)域。然后，在全局范圍內(nèi)，空間區(qū)域的通路活動概況顯示出特定的激活模式。與 NAG 組相比，EGC 組的 MYC 信號傳導(dǎo)、氧化磷酸化、干擾素 α 反應(yīng)、IL-1 信號傳導(dǎo)、mTORC1 信號傳導(dǎo)、TNF 信號傳導(dǎo)和髓系白細(xì)胞介導(dǎo)的免疫均上調(diào)，而 AG 中，脂肪酸代謝、異生素代謝和脂質(zhì)代謝上調(diào)。相反，在 NAG 組中上調(diào)的 KRAS 信號通路、天冬氨酸型肽酶活性、B 細(xì)胞受體信號通路和細(xì)胞識別通路在 EGC 組中均下調(diào)。雖然發(fā)現(xiàn)通路活動部分與特定細(xì)胞類型相關(guān)，例如肌肉區(qū)域與活化的凝血通路一致。對于大多數(shù)通路，它們的活性在每個點(diǎn)上是不均勻的，并且難以與特定的細(xì)胞類型匹配，一方面是技術(shù)限制，另一方面是復(fù)雜的微環(huán)境。此外，通過時間軌跡分析，從NAG、AG到EGC細(xì)胞有進(jìn)化趨勢，基因表達(dá)也有明顯變化。鑒于此，使用 scRNA-seq 進(jìn)一步探索了三組細(xì)胞特征和基因表達(dá)譜的差異。使用 10x scRNA-seq 從 6 個新鮮的 NAG、AG 和 EGC 胃鏡活檢標(biāo)本中收獲了 28,860 個細(xì)胞。然后對所有細(xì)胞進(jìn)行合并、過濾、歸一化、批量校正、聚類，最終確定了通過質(zhì)量控制的21848個細(xì)胞中的17種細(xì)胞類型。上皮細(xì)胞、T細(xì)胞、漿細(xì)胞占較大部分，成纖維細(xì)胞和壁細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量相近。此外還有內(nèi)皮細(xì)胞、B細(xì)胞、肥大細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、主細(xì)胞等，數(shù)量較少。不同組和樣本中每種細(xì)胞類型的分布是均勻的，表明在 scRNA-seq 數(shù)據(jù)中沒有批次效應(yīng)。特征基因的表達(dá)表明注釋的正確性。
探索了每種細(xì)胞類型的起源，發(fā)現(xiàn)不同組之間存在相當(dāng)大的異質(zhì)性。上皮細(xì)胞在胃組織中的數(shù)量最多，其中大部分來自EGC。parietal cells存在于胃腺中，與標(biāo)本來源的上皮細(xì)胞一致。對于成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和pericytes，從 NAG、AG 到 EGC 減少，表明血管和平滑肌組織逐漸減少，這可能是由于活檢標(biāo)本的采樣差異略小。對于chief cells，減少與 SPEM 的特征相符。此外，探討了在 SPEM 的 GC 進(jìn)展中涉及的 TFF2 的表達(dá)，這意味著 SPEM 可能在我們的研究中發(fā)生。此外，值得注意的是，在 EGC 樣本中，一組稱為增殖細(xì)胞的比例最高，表明在胃癌發(fā)展過程中增殖能力增強(qiáng)。同時，增殖細(xì)胞顯著表達(dá)CD3D、CD3E等T細(xì)胞標(biāo)志物，提示T細(xì)胞在胃癌進(jìn)展中的增殖能力受到刺激。
然后，使用 SPOTlight(關(guān)于SPOTlight，大家可以參考我的文章10X單細(xì)胞空間分析回顧之SPOTlight)，對匹配 scRNA-seq 數(shù)據(jù)的 ST 數(shù)據(jù)進(jìn)行反卷積。結(jié)果，獲得了每個spot的細(xì)胞類型成分。除肌層和淋巴細(xì)胞聚集區(qū)外，上皮細(xì)胞分布廣泛。 T 細(xì)胞和 B 細(xì)胞相互靠近，我們觀察到在淋巴細(xì)胞聚集區(qū)，T 細(xì)胞和 B 細(xì)胞占據(jù)了較高的比例。與T細(xì)胞和B細(xì)胞相比，漿細(xì)胞存在于淋巴細(xì)胞聚集區(qū)的外側(cè)。平滑肌細(xì)胞主要存在于肌層，反映在HE上，在一定程度上證明了細(xì)胞定位的準(zhǔn)確性。Schwann 細(xì)胞、pericytes 細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的共定位表明這些細(xì)胞和平滑肌可能是肌肉層的主要細(xì)胞成分。與其他免疫細(xì)胞相比，巨噬細(xì)胞更傾向于存在于組織邊緣，chief細(xì)胞也避開了淋巴細(xì)胞聚集的區(qū)域，這與上皮細(xì)胞一致。此外，還注意到在 NAG 中，增殖細(xì)胞主要聚集在淋巴細(xì)胞聚集區(qū)，而在其他兩組中則聚集在上皮區(qū)域，這表明增殖細(xì)胞可能具有不同的表型和功能，包括 NAG 中的免疫細(xì)胞表型和上皮細(xì)胞表型。在 AG 和 EGC 中。還存在有趣的現(xiàn)象，NAG中淋巴細(xì)胞聚集面積最大，AG和EGC中淋巴細(xì)胞聚集面積減小，說明NAG免疫防御功能最強(qiáng)。
先前的研究表明，腫瘤進(jìn)展通常伴隨著增加的拷貝數(shù)變異 (CNV)。 然而，CNVs 對 GC 進(jìn)展幾乎沒有影響，部分原因是胃組織的全局差異很小。 與之前的工作一致，在從 NAG 到 EGC 的進(jìn)展過程中，CNV 評分沒有顯著差異。 數(shù)據(jù)表明，NAG、AG和EGC組的基因表達(dá)譜和微環(huán)境細(xì)胞特征存在明顯變化。
Different expression patterns of T cells from NAG to EGC
我們注意到，在腫瘤微環(huán)境中起關(guān)鍵作用的 T 細(xì)胞在免疫細(xì)胞中所占的比例最大。然后，從三組中提取所有 T 細(xì)胞，然后降低維數(shù)并重新聚類它們。根據(jù)基因表達(dá)，我們將 T 細(xì)胞分為八個clusters，包括細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞 (Cytotoxic T)、輔助 T 細(xì)胞 (Th)、自然殺傷細(xì)胞 (NK)、雙陰性 T 細(xì)胞 (DNT)、調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞 (Treg) 、幼稚T細(xì)胞（naive T）、衰竭T細(xì)胞（Exhausted T），以及表達(dá)高水平上皮相關(guān)基因的一種特殊T細(xì)胞類群，稱為上皮樣T細(xì)胞（epithium_like）。來自每位患者的 T 細(xì)胞分散分布。在不同的 T 細(xì)胞樣本中發(fā)現(xiàn)了很大的異質(zhì)性。 T細(xì)胞的組成和比例在不同的疾病階段表現(xiàn)出不同的特點(diǎn)。例如，在 NAG 和 AG 階段，DNT 占較大比例。值得注意的是，一個樣本GN1_1，屬于AG重度IM患者，T細(xì)胞比例與GN1_3相似，而后者與AG相似。這在一定程度上證明了AG是介于NAG和EGC之間的中間狀態(tài)，而IM是接近EGC的狀態(tài)。對于 T 細(xì)胞亞群，DNT（CD3+CD4-CD8-T 細(xì)胞）在總 T 細(xì)胞中的比例最高。細(xì)胞毒性T細(xì)胞和耗竭T細(xì)胞僅存在于EGC和AG樣本中，隨著疾病進(jìn)展，DNT細(xì)胞比例逐漸降低。 Na?ve T、Th、NK 細(xì)胞呈增加趨勢。同時，使用經(jīng)典標(biāo)記來表征聚類的正確性。可以看出，標(biāo)記基因在特定的T細(xì)胞中呈現(xiàn)特異性表達(dá)。
使用熱圖顯示了 T 細(xì)胞亞群的前 10 個DEGs。 熱圖中 DEGs 的表達(dá)進(jìn)一步驗(yàn)證了標(biāo)注的準(zhǔn)確性。 對于細(xì)胞毒T細(xì)胞，除細(xì)胞毒基因外，KLRC1 25、ZNF68326也高表達(dá)，與NK細(xì)胞相互作用。 細(xì)胞毒性T細(xì)胞和衰竭T細(xì)胞的基因表達(dá)有一定的相似性。 但 DUSP4 在耗盡的 T 細(xì)胞中較高，而 DUSP2 在細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞中較高。 激活NK細(xì)胞細(xì)胞毒性的KIR2DL4在耗盡的T細(xì)胞中含量較高，表明細(xì)胞毒性T細(xì)胞和耗盡的T細(xì)胞都可以與NK細(xì)胞相互作用。 DNT專注于熱休克蛋白相關(guān)基因，包括HSPA1A、HSPA1B、DNAJB1、DNAJA1。 DDX3X 與 NLRP3 炎性體的形成有關(guān)。 EZR和MYH9與遷移和侵襲等細(xì)胞極性有關(guān)。
對總 T 細(xì)胞的軌跡分析，發(fā)現(xiàn)沒有明顯的發(fā)育模式。 然而，當(dāng)只關(guān)注細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞和耗盡 T 細(xì)胞時，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞先于耗盡 T 細(xì)胞，并且大部分耗盡 T 細(xì)胞整體聚集在分支末端，這意味兩種細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)化。 比較了細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞和耗盡的 T 細(xì)胞之間功能基因的表達(dá)。 對于包括IFNG、NKG7、PRF1、GZMA、GZMB、GZMH在內(nèi)的細(xì)胞毒基因，兩種細(xì)胞類型之間沒有差異。 但對于包括 LAG3、PDCD1、CTLA4 以及 TIGIT 在內(nèi)的免疫檢查點(diǎn)，耗盡的 T 細(xì)胞的表達(dá)明顯更高。 相同的細(xì)胞cluster在不同的患者中可能表現(xiàn)出不同的狀態(tài)，通過尋找DEGs，得到了AG和EGC組中細(xì)胞毒性T細(xì)胞和耗盡T細(xì)胞DEGs的數(shù)量。
細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞和耗盡的 T 細(xì)胞之間的總通路激活模式相似，而后者的活性更高，除了用于 IgA 產(chǎn)生的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)、WNT β-連環(huán)蛋白信號、DNA 甲基化信號傳導(dǎo)主要富集在耗盡的 T 細(xì)胞中。 比較AG組細(xì)胞毒性T細(xì)胞和耗竭T細(xì)胞，EGC組細(xì)胞在TRAF6介導(dǎo)的IRF7激活通路、RUNX3通路、INF信號通路、CXC趨化因子受體信號通路和對腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)等通路中表現(xiàn)出更高的活性。
然后，使用 SPOTlight 定位細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞和耗盡的 T 細(xì)胞。 兩類細(xì)胞分布有一定相似性，但細(xì)胞毒性T細(xì)胞分布范圍更廣。
在分析 T 細(xì)胞亞群時，發(fā)現(xiàn)一組既不表達(dá) CD4 也不表達(dá) CD8 的細(xì)胞，稱之為 DNT。 同時，DNT的數(shù)量為1890個，占T細(xì)胞的39%，占所有細(xì)胞的8.7%。 雖然有一些關(guān)于 DNT 的報(bào)道，但 DNT 的作用和效果還不是很清楚，而且迄今為止在 GC 中也沒有關(guān)于 DNT 的報(bào)道，那么下面重點(diǎn)介紹一下 DNT。
探討了 DNT 三組之間的差異。 軌跡分析表明，隨著疾病的發(fā)展，DNT 會逐步改變。 檢查了 DNT 在偽時間的基因表達(dá)，熱休克蛋白相關(guān)基因如 HSPA9、HSPA1A、HSPA1B、HSP90AB1 以及 DEAD-box 解旋酶基因如 DDX5、DDX3X、DDX3Y 逐漸減少。 相反，隨著CD8A、GZMK的上調(diào)，CD8+ T細(xì)胞的表型逐漸顯現(xiàn)。 在偽時期后期，JCHAIN基因和IG相關(guān)基因在漿細(xì)胞中高表達(dá)。 DNT pseudotime的基因表達(dá)表明向CD8+ T細(xì)胞和漿細(xì)胞的轉(zhuǎn)變可能發(fā)生在DNT的后期發(fā)育過程中。
SPOTlight 顯示 DNT 廣泛分布。 但有趣的是，與其他區(qū)域相比，淋巴細(xì)胞聚集區(qū)域聚集的 DNT 較少。 在癌變部位，DNT含量相對較多。 結(jié)合monocle的結(jié)果，我們猜測DNT可能轉(zhuǎn)化為CD8+T細(xì)胞，在病灶部位發(fā)揮抑癌作用。
The dysregulation of B cells development during EGC progression
與 T 細(xì)胞相比，B 細(xì)胞群在亞組之間表現(xiàn)出較少的數(shù)量和多樣性。 根據(jù)獨(dú)特的標(biāo)記基因，這些細(xì)胞分為B細(xì)胞（CD19、CD20/MS4A1、FCER2和MHC II分子）和plasmas（TNFRSF17、SLAMF7、XBP1、SDC1和IGHs）。 與以往胃組織中含有大量plasmas的研究一致，也發(fā)現(xiàn)了迄今為止機(jī)制未知的現(xiàn)象。 空間位置也表明plasmas的擴(kuò)散分布，而 B 細(xì)胞稀少。 然而，在 NAG、AG 和 EGC 組之間，B 細(xì)胞和plasmas的細(xì)胞數(shù)量分別相當(dāng)。
更高分辨率的聚類顯示 B 細(xì)胞中有 7 個不同的亞組。 B-c0和B-c5主要來源于非EGC組，而在B-c1、B-c2、B-c3、B-c4和B-c6中，EGC和AG組細(xì)胞占優(yōu)勢。基因表達(dá)分析顯示B-c0和B-c5、DDX5、DDX3X和NCL之間相似的上調(diào)基因均為抗病原體和抗腫瘤基因。由于大量癌基因在 B-c1 clusters中顯著上調(diào)，推斷它正在惡化由腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的細(xì)胞群。然后，通路活性分析表明促腫瘤信號的活性高度上調(diào)，這也顯示了這些細(xì)胞的惡性潛能。對于B-c2 cluster，RGS13、MEF2B、GCSAM和LRMP這些germinal center發(fā)育的必需基因被上調(diào)。然而，通常在受感染的記憶 B 細(xì)胞上表達(dá)的 FCRL4，它的過度表達(dá)也可能阻礙抗原誘導(dǎo)的 BCR 信號傳導(dǎo)。此外，據(jù)報(bào)道促進(jìn)腫瘤發(fā)展的 ACTG1 和 FAM3C 在該cluster中也上調(diào)。對于B-c3，它被定義為表達(dá)IGHD和FCER2的濾泡B細(xì)胞。 TCL1A、TNFAIP3、BTG1 和 TXNIP、促腫瘤或促炎基因也在該cluster中表達(dá)。對于 B-c4，它被定義為記憶 B 細(xì)胞，標(biāo)記基因 FABP5 據(jù)報(bào)道調(diào)節(jié)脂肪酸代謝。在 B-c6 中，據(jù)報(bào)道 SIK2 通過 PI3K/AKT/HIF 軸調(diào)節(jié)代謝重編程，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展; WDR76可以激活脂肪代謝限制； CNR2可能抑制抗體反應(yīng)，據(jù)報(bào)道是B細(xì)胞限制葡萄糖和能量供應(yīng)的中樞效應(yīng)物，這反過來表明該cluster與B細(xì)胞的代謝變化有關(guān)。
TF 分析確定了 IRF8、PAX5 和 SPIB，這是眾所周知的對 B 細(xì)胞發(fā)育至關(guān)重要的 TF，CREB3L2 和 XBP1 對漿細(xì)胞的成熟。 此外，EGR3、KLF12、MECP2、HDAC1 和 SOX5 的轉(zhuǎn)錄活性在 c0-mermory B 細(xì)胞和 c5-na?ve B 細(xì)胞中更高。 相反，F(xiàn)OXP1、HMGB1、EGR1 和 BCL11A 在這些clusters中較低，但在其他 B 細(xì)胞cluster中較高。 據(jù)報(bào)道，F(xiàn)OXP1 在germinal center B 細(xì)胞中表現(xiàn)出生理性減少，這意味著 FOXP1 的高活性導(dǎo)致 B 細(xì)胞幼稚化。 HMGB1 可在缺氧或炎癥刺激后被激活。 BCL11A可以在B細(xì)胞的早期發(fā)揮作用。 EGR3可以通過抗原受體信號傳導(dǎo)和控制炎癥來調(diào)節(jié)B細(xì)胞的增殖。 HDAC1可以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的G1-S期轉(zhuǎn)變，它的消融在早期阻斷了B細(xì)胞。 SOX5對記憶B細(xì)胞的發(fā)育很重要。
隨著對漿細(xì)胞的進(jìn)一步解剖，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞具有從漿母細(xì)胞、短期漿細(xì)胞到長期漿細(xì)胞的進(jìn)化軌跡。 考慮到親和力成熟期間的體細(xì)胞超突變 (SHM) 和類別轉(zhuǎn)換，漿細(xì)胞可以獲得比 B 細(xì)胞更多的變異，inferCNV 分析也表明了這些差異。
有趣的是，空間特征圖像顯示了胃組織中漿細(xì)胞和上皮細(xì)胞的彌散分布，另一方面，兩種細(xì)胞類型之間難以清晰的聚類。 因此，使用 IF 來確定它們的空間位置。 我們發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞類型之間存在大量鄰域關(guān)系，尤其是在 EGC 患者中。
由于 NAG、AG 和 EGC 患者之間的 TCR 克隆型不同，分析還確定了 BCR 信息。 從 NAG、AG 到 EGC 組，克隆型的多樣性增加。 此外，三組中無論是重鏈還是輕鏈的V-J對都是獨(dú)特且不同的。
Characteristics of myeloid cells in the TME of EGC
然后，剖析了本研究中揭示的骨髓亞群的基因特征。 兩個肥大細(xì)胞clusters表達(dá)了典型的基因模式，例如 TSPAB1、TPSB2、CPA3 和 KIT，并通過 PGA3、NEAT1、HSP90AB1 和 TNFAIP3、AREG、MIF 的獨(dú)特表達(dá)進(jìn)一步區(qū)分。 值得注意的是，先前的研究表明，TNFAIP3的上調(diào)可以促進(jìn)胃癌的發(fā)展，而AREG可以增強(qiáng)Tregs的抑制功能。 這兩個集群在 EGC、AG 和 NAG 組中顯示出不同的富集。 Mast c0 集群在所有三個組中或多或少均勻地存在，而 mast c1 在 NAG 組中幾乎消失。 特定的分布可能意味著它們發(fā)揮不同的生物學(xué)作用。通路評分顯示肥大 c0 cluster與 KRAS 信號通路、腸道吸收、ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和 Hedgehog 信號通路相關(guān)。 Mast c1 cluster傾向于成為惡性細(xì)胞群，并顯著富集 PI3K-AKT-mTOR、ɑ-TNF、脂肪酸代謝、缺氧、炎癥反應(yīng)和 IFN-γ 信號蛋白。
TF分析表明JUND、MAFF、PRDM1、FOSL2、TCF7L2和HES1在巨噬細(xì)胞c0 cluster中被激活，而FOXO1、FOXO3和MEF2A的TF活性在巨噬細(xì)胞c1 cluster中較高。 對于肥大細(xì)胞，AHR、GATA1、GATA2 是眾所周知的 TF，而 RELA、EGR3 和 ZC3H11A 在肥大 c0 clusters中較高。 HIVEP2、ATF4、VDR、ATF5 和 IRF4 在中性粒細(xì)胞/DC 細(xì)胞中具有更高的活性。
根據(jù)C1QA、C1QB、C1QC和CD163的特異性表達(dá)鑒定了兩個巨噬細(xì)胞cluster。其中，三組中顯示顯著（巨噬細(xì)胞c0 cluster）或輕微（巨噬細(xì)胞c1 cluster）偏態(tài)分布的cluster。 在巨噬細(xì)胞c0 cluster中觀察到MMP9、CXCL2、MMP12和CTSH的表達(dá)，兩者在巨噬細(xì)胞c1 cluster中均表現(xiàn)出較低的表達(dá)。 其余 cluster 是中性粒細(xì)胞/DC 群，其特征是 S100A8、A100A9、G0S2 和 LSP1 的高表達(dá)。 大部分 cluster 起源于EGC患者，基因表達(dá)以及富集途徑的活動也偏向于促腫瘤。 巨噬細(xì)胞和DC群均表現(xiàn)出抗原呈遞細(xì)胞（APC）的特征，具有抗原加工和呈遞的能力。 除此之外，細(xì)胞粘附分子 cams、用于 IgA 產(chǎn)生的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)和補(bǔ)體凝血級聯(lián)信號也在這些細(xì)胞中被激活。
The ligand-receptor interactions of immune cells along with EGC progression（通訊分析）
至于組織微環(huán)境，尤其是腫瘤組織中復(fù)雜且高頻的相互作用。進(jìn)一步評估了 NAG、AG 和 EGC 組之間的細(xì)胞相互作用。三組間分泌信號、細(xì)胞間接觸信號和ECM受體信號的相互作用強(qiáng)度和數(shù)量均不同。與 NAG 組相比，AG 和 EGC 組之間的相互作用數(shù)量和強(qiáng)度是可比較的，表明 AG 患者含有驅(qū)動早期腫瘤發(fā)生的條件。配體-受體的差異分析表明，LGALS9_CD44、LGALS9_CD45、LGALS9 - HAVCR2(TIM-3)、MIF-CD74/CD44、MIF-CD74/CXCR4和MDK-NCL是主要的相互作用。我們發(fā)現(xiàn) LGALS9 在肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、壁細(xì)胞和杯狀細(xì)胞中上調(diào)。據(jù)報(bào)道，LGALS9_CD45 可抑制 B 細(xì)胞受體信號 64。LGALS9_CD44 可增強(qiáng) Treg 的穩(wěn)定性和功能。此外，LGALS9 可以與 HAVCR2 (TIM-3) 相互作用，以保護(hù)乳腺癌免受 T 細(xì)胞的細(xì)胞毒性殺傷，部分通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或效應(yīng) T 細(xì)胞耗竭。據(jù)報(bào)道，TIM-3是Th1細(xì)胞的一種特異性表面分子，可介導(dǎo)Th1免疫反應(yīng)，其失調(diào)可導(dǎo)致抑制炎癥反應(yīng)甚至逃避腫瘤。它可以促進(jìn) CD8+ T 細(xì)胞耗竭并誘導(dǎo)髓源性抑制細(xì)胞 (MDSCs) 的產(chǎn)生。在我們的研究中，TIM-3 主要在骨髓細(xì)胞中表達(dá)，這與之前的報(bào)道一致，即 TIM-3 表達(dá)主要定位于人和小鼠腫瘤中的骨髓細(xì)胞。肥大細(xì)胞中的 TIM-3 可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。巨噬細(xì)胞遷移抑制因子 (MIF) 是適應(yīng)性和先天免疫的上游調(diào)節(jié)因子，但如果失調(diào)，它是急性或慢性炎癥的關(guān)鍵驅(qū)動因素，并在白細(xì)胞募集中起作用。 MIF發(fā)生在AG組和EGC組的多種免疫細(xì)胞中。 CXCR4是MIF的受體之一，在EGC組，尤其是B細(xì)胞和T細(xì)胞群中高表達(dá)。據(jù)報(bào)道，CXCR4可以阻礙其他腫瘤的T淋巴細(xì)胞浸潤和免疫治療。 CD74/CD44作為MIF的受體復(fù)合物，其激活可觸發(fā)多種細(xì)胞內(nèi)信號通路，包括ERK通路、PI3K/AKT信號、NFκB和MAPK通路。由于缺氧通路在胃炎條件下被激活，據(jù)報(bào)道，HIF-1α-和 HIF-2α-依賴性 MIF 可以部分通過與 CD74/CXCR4 復(fù)合物相互作用來調(diào)節(jié)骨髓細(xì)胞的功能，然后激活 p38/MAPK 和 PI3K- AKT 信號。另一方面，該復(fù)合物還可以作為 B 細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和成熟的正調(diào)節(jié)劑。據(jù)報(bào)道，Midkine (MDK) 支持胃癌的進(jìn)展，部分是通過抑制顆粒酶 B (GZMB) 的表達(dá)和 NK 細(xì)胞的細(xì)胞毒性，以及通過與表面核仁素 (NCL) 相互作用在缺氧條件下增加表皮生長因子受體 (EGFR) 信號傳導(dǎo)）。它還被鑒定為有助于 GC 細(xì)胞中的多藥耐藥性。此外，MDK 重新連接黑色素瘤和膽囊癌的免疫抑制環(huán)境。在這項(xiàng)研究中，我們發(fā)現(xiàn)與 NAG 患者相比，MDK 在 EGC 和 AG 患者中過表達(dá)。 MDK 的受體之一是 NCL，它是生長細(xì)胞的主要核仁蛋白，也可作為細(xì)胞表面受體在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核之間穿梭，從而為細(xì)胞外調(diào)節(jié)核事件提供機(jī)制。
Discussion
為了探索從胃炎到早期胃癌的免疫微環(huán)境變化，首先綜合運(yùn)用單細(xì)胞測序和空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)對免疫細(xì)胞成分和空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解剖。 雖然之前有過一些胃癌相關(guān)的研究，但它們要么集中在胃癌中的惡性細(xì)胞，要么僅以單細(xì)胞分辨率關(guān)注胃癌中的其他非免疫細(xì)胞，或者用其他空間方法如 DSP 代替 ST。
全局通路富集和空間區(qū)域分析表明，與NAG組相比，AG階段激活了缺氧條件、活性氧通路和脂肪代謝等多個通路，均有利于EGC的進(jìn)展和抑制性免疫微環(huán)境的形成。 雖然 MYC、INFα、IL-1 和 TNF 信號傳導(dǎo)，但所有腫瘤相關(guān)通路在 EGC 組中均被激活。 整體變化暗示了組合物的異質(zhì)性。 然后在這項(xiàng)研究中，發(fā)現(xiàn)了多種免疫細(xì)胞，包括 T 細(xì)胞、B 細(xì)胞和骨髓細(xì)胞，它們在 EGC、AG 和 NAG 患者中具有不同的狀態(tài)和表達(dá)模式。
當(dāng)胃病從 NAG 進(jìn)展到 EGC 時，T 細(xì)胞的效應(yīng)和抑制狀態(tài)之間的平衡逐漸受損。具體而言，在AG和EGC階段出現(xiàn)耗竭的T細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞，在NAG狀態(tài)下不存在，免疫反應(yīng)明顯激活。這與先前的研究一致，即早期腫瘤進(jìn)展伴隨著免疫反應(yīng)激活。除了存在耗盡的T細(xì)胞外，TME、Tregs的另一個天然抑制作用，在NAG階段上調(diào)HIVEP1和STAT3的轉(zhuǎn)錄活性，而在AG狀態(tài)增強(qiáng)IRF4和IKZF2的活性，并具有更高的FOXP3轉(zhuǎn)錄活性, BATF, 和 EGC 時期的 PRDM1。其中，HIVEP1 是 Tregs 中新發(fā)現(xiàn)的 TF，剛剛報(bào)道它在 TNFRSF9+ Treg 細(xì)胞中高度激活，在軌跡的后期，呈現(xiàn)出與我們的結(jié)果不同的模式。正如之前的報(bào)道，PRDM1 通常在晚期或終末期上調(diào)轉(zhuǎn)錄活性，這意味著免疫效果更差。從 NAG 到 EGC 進(jìn)展過程中轉(zhuǎn)錄因子活性的這些變化可能表明 T 細(xì)胞的抑制作用是早期胃癌的促成因素之一。以上也表明，AG患者已經(jīng)開始出現(xiàn)衰竭或抑制性免疫反應(yīng)，暗示EGC的預(yù)防措施可能應(yīng)從這個階段開始實(shí)施。此外，我們在T細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了一種罕見的細(xì)胞類型，即DNT細(xì)胞，它占據(jù)了很大一部分，但具有不確定的標(biāo)記基因來定義它們，這與之前的報(bào)道一致。時間軌跡顯示了DNT從NAG、AG到EGC的不斷演變，沒有足夠的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，因此它們存在的意義尚不清楚，值得未來進(jìn)一步研究。
然后，與 T 細(xì)胞一樣，B 細(xì)胞也出現(xiàn)了失調(diào)。 FOXP1 和 BCL11A 在cluster（B-c1、B-c2、B-c3、B-c4 和 B-c6）中較高的轉(zhuǎn)錄活性，在 AG 和 EGC 組中富集更多，代表 B 細(xì)胞的幼年化。 此外，SOX5的轉(zhuǎn)錄抑制表明成熟記憶B細(xì)胞的喪失，以及正調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的EGR3和HDAC1活性較低的成熟障礙。 比較 B 細(xì)胞，漿細(xì)胞中富含胃組織，與之前的報(bào)道相同。 我們發(fā)現(xiàn)了一個有趣的現(xiàn)象，即漿細(xì)胞共定位或伴有上皮細(xì)胞，特別是在 EGC 組中，這通過標(biāo)記基因表達(dá)的 ST 圖像和 IF 染色證實(shí)。 然而，細(xì)胞相互作用無法找到該現(xiàn)象的線索，顯示出進(jìn)一步深入探索的可能性。
有兩個惡性clusters，Mast c1 和巨噬細(xì)胞 c0，主要富集于 AG 和 EGC 組，表達(dá)高水平的基因，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展并抑制有效的免疫反應(yīng)。 至于在 Mast c1 中上調(diào)的 AREG，可以與 EGFR 相互作用以執(zhí)行 Tregs 的功能。 主要在骨髓細(xì)胞中表達(dá)的 LGALS9 可以與 TIM-3 相互作用發(fā)揮免疫抑制作用。 此外，MIF-CD74/CXCR4和MDK-NCL均可在缺氧條件下激活，分別調(diào)節(jié)T細(xì)胞或骨髓細(xì)胞的功能。
這項(xiàng)研究的優(yōu)勢來自于組合技術(shù)的應(yīng)用：空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)、scRNA-seq 和 VDJ 分析。 Visium ST 使我們能夠確定不同組織中細(xì)胞類型的位置； 雖然 scRNA-seq 無法像普通 RNA-Seq 那樣獲得足夠深度的基因表達(dá)，但它使我們能夠確認(rèn)胃癌進(jìn)展過程中免疫微環(huán)境中的已知細(xì)胞類型，以及單獨(dú)的稀有細(xì)胞類型，如雪旺細(xì)胞和 DNT 細(xì)胞。
Overall, we characterized the dysregulation of immune microenvironment changes both in single-cells and spatial transcriptome resolution, the multi-omics data presented in this study offer a comprehensive view of immune cell types, states change and locations within the gastric tissues during the progression from NAG, AG to EGC, advancing our understanding of the composition and immunity of different gastric states, offering diagnostic and preventive thoughts for EGC.
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