我們常見的轉錄組表達分析一般都是將reads比對至參考基因組或者轉錄組上，然后在基因或者轉錄本水平上定量表達豐度。
但最近在做小RNA分析時卻遇到了沒有參考基因組注釋文件（gtf/gff文件）的情況，而注釋文件的缺失則意味傳統(tǒng)的轉錄組定量分析是無法進行的。那在缺少注釋文件的情況下，該如何進行定量分析呢？在各種搜索后發(fā)現(xiàn)了一款無需mapping便可進行定量的軟件——Salmon。
一、基本情況
Salmon軟件于2017年發(fā)表在Nature Methods，其題目為《Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression》
Salmon 提供2種運行模式，一是quasi-mapping直接讀取 reads 文件；二是讀取比對文件 sam/bam 進行mapping。
1、quasi-mapping-based mode的運行有兩階段：構建索引和用戶想要定量的reads文件。
2、alignment-based mode的運行則不需要構建索引，而是僅需提供一個轉錄本的 FASTA文件和用戶想要定量的 SAM/BAM 文件。
二、軟件使用：
1、quasi-mapping-based mode
構建索引：
salmon index -t transcripts.fa -i transcripts_index -k 31
參數(shù)說明：
-t：轉錄本的fasta文件
-i：輸出目錄
-k：K-mers，默認值為31
#如果你的reads大于75bp，那么k設置為31是較好的選擇，如果reads低于75可略微減少K值
名詞解釋：
簡單來說，k-mer是一段長度為k的序列，而后面的mer即為monomeric unit（單體單元），也就是每個堿基。因k-mer包含k個堿基，若一段核酸序列長度為L，以一個堿基為步長滑動，那么根據(jù)這個核酸序列就可以得到L-k+1個k-mer；由于每個位點的堿基可以為（A、T、C、G）中的任意一個，因此k-mer理論上說有個不同的序列。原本一條長片段，就變成了很多短的片段，因此計算機處理的堿基數(shù)量也會增加很多倍。而且，每次取k-mer是同一條reads正反取兩次，這就是對這條reads的反向互補序列再取一次k-mer。下面的圖就形象化了這一過程，長度為15的序列，選取k-mer為5，那么就會得到11（15-5+1=11）個5-mer。
定量分析：
#雙端測序數(shù)據(jù)reads表達量的估計
salmon quant -i transcripts_index -l <LIBTYPE> -1 reads1.fq -2 reads2.fq -o transcripts_quant
#單端測序數(shù)據(jù)reads表達量的估計
salmon quant -i transcripts_index -l <LIBTYPE> -r reads.fq -o transcripts_quant
參數(shù)說明：
-1/2：雙端數(shù)據(jù)
-r：單端數(shù)據(jù)
-l：--libType，測序文庫類型，一般不知道什么文庫的話用參數(shù) A 讓軟件自動檢測
#I = inward
#O = outward
#M = matching
#S = stranded
#U = unstranded
#F = read 1 (or single-end read) comes from the forward strand
#R = read 1 (or single-end read) comes from the reverse strand
#A = automatically determine
2、alignment-based mode
該模式下無需創(chuàng)建索引
salmon quant -t transcripts.fa -l <LIBTYPE> -a aln.bam -o salmon_quant
3、輸出文件
主要輸出文件為quant.sf，該文件共有5列，分別是Name，Length ，EffectiveLength，TPM和NumReads。
- Name — target transcript 名稱， 由輸入的 transcript database (FASTA file)所提供。
- Length — target transcript 長度，即有多少個核苷酸
- EffectiveLength — target transcript 計算的有效長度。此項考慮了所有被建模的因素，這將影響從這個轉錄本中取樣片段的概率，包括片段長度分布和序列特異性和gc片段偏差（如果這些因素在建模時均被考慮的話）。 （It takes into account all factors being modeled that will effect the probability of sampling fragments from this transcript, including the fragment length distribution and sequence-specific and gc-fragment bias (if they are being modeled)）。
- TPM — 估計轉錄本的表達量。
- NumReads — 估計比對到每個轉錄本的reads數(shù)。
其他輸出文件：
cmd_info.json： JSON格式文件，記錄salmon程序運行的命令和參數(shù)
lib_format_counts.json： Observed library format counts。當運行salmon是 mapping-based mode時，則會生成改文件。 JSON格式文件，記錄有關文庫格式和reads比對的情況。
eq_classes.txt： Equivalence class file。當Salmon運行時，應用參數(shù)--dumpEq，則會生成此文件。
aux_info： 輔助文件夾，內含多個文件
fld.gz：在輔助文件夾中，該文件記錄的是觀察到的片段長度分布的近似值
obs5_seq.gz, obs3_seq.gz, exp5_seq.gz, exp5_seq.gz： Sequence-specific bias files
expected_gc.gz, observed_gc.gz： 當Salmon運行時，應用fragment-GC bias correction，在輔助文件夾中則會生成這兩個文件。記錄Fragment-GC bias。
meta_info.json： JSON格式文件，記錄salmon程序運行的統(tǒng)計信息
ambig_info.tsv： tab分隔符的文本文件，含有兩列。記錄的是每個轉錄本對應的 the number of uniquely-mapping reads 和 the total number of ambiguously-mapping reads
三、補充
TPM：
Transcripts Per Kilobase of exonmodel per Million mapped reads (每千個堿基的轉錄每百萬映射讀取的Transcripts)，優(yōu)化的RPKM計算方法，可以用于同一物種不同組織的比較。
TPM概括了基因的長度、表達量和基因數(shù)目。TPM可以用于同一物種不同組織間的比較，因為sum值總是唯一的。
計算公式：PMi=(Ni/Li)*1000000/sum(Ni/Li+……..+ Nm/Lm)
其中：Ni：mapping到基因i上的read數(shù)； Li：基因i的外顯子長度的總和
http://blog.sciencenet.cn/blog-1113671-1038659.html
參考：
https://www.bioinfo-scrounger.com/archives/411/
Salmon 進行轉錄本定量http://www.itdecent.cn/p/f62fd85113d3
tximport 將 Salmon 定量結果導入 DESeq2http://www.itdecent.cn/p/e0acb957b351
salmon分析RNA-seq實戰(zhàn)http://www.itdecent.cn/p/5ffbe89d3b6b
