在毛細(xì)管層析作用下，基于抗原抗體特異性結(jié)合或核酸探針和靶向核酸雜交反應(yīng)來檢測樣品中的目標(biāo)物質(zhì)的側(cè)流層析技術(shù)與傳統(tǒng)檢測方法相比，以其成本低、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性高、節(jié)省時間、不需專業(yè)人員、可現(xiàn)場檢驗、結(jié)果肉眼可見等優(yōu)勢，廣泛運(yùn)用在人體臨床醫(yī)學(xué)、動植物醫(yī)學(xué)、食品安全、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域。本文重點(diǎn)介紹側(cè)流層析技術(shù)的背景、原理、設(shè)計以及國內(nèi)外應(yīng)用現(xiàn)狀、發(fā)展前景等。
近年來，快速檢測需求的增加刺激了新技術(shù)在臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測和食品安全分析等領(lǐng)域的發(fā)展。目前已有很多技術(shù)可用于檢測小分子和生物大分子，包括氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、高效液相色譜技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附檢測（enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA）技術(shù)和生物傳感器技術(shù)等。這些技術(shù)大都特異性強(qiáng)、靈敏度高，但耗時長且需要昂貴的儀器以及專業(yè)的操作人員。和傳統(tǒng)方法相比，側(cè)流層析技術(shù)（lateral flowchromatographic assay，LFCA）有很多優(yōu)勢，如成本低、易操作、快速、可實現(xiàn)現(xiàn)場檢測及結(jié)果肉眼可見等?；谏鲜鰞?yōu)勢，自LFCA出現(xiàn)以來，其在基礎(chǔ)及應(yīng)用研究領(lǐng)域取得了快速的發(fā)展。
1980年首次研制出檢測人絨毛膜促性腺激素的LFCA試紙被用以診斷早孕。自此以后，LFCA被廣泛的運(yùn)用于檢測各種分子，包括腫瘤標(biāo)志物、微生物、霉菌毒素、重金屬和農(nóng)藥等。本文主要從LFCA的原理、技術(shù)結(jié)構(gòu)、研究動態(tài)等方面予以闡述。
** 一、LFCA的技術(shù)原理及設(shè)計**
LFCA主要是基于免疫識別或者核酸雜交以及抗體標(biāo)記技術(shù)，使待檢測物中各組分（抗原、抗體、蛋白質(zhì)、核酸等）通過毛細(xì)管作用力的移動速度差異，在反應(yīng)基質(zhì)上實現(xiàn)分離的色譜系統(tǒng)。
01
LFCA的基本組成
LFCA由4 個部分組成，即樣品墊、結(jié)合墊、層析膜和吸水墊，將這4 個部分疊加于支撐底板上就構(gòu)成了一個簡易的LFCA試紙條（圖1）。樣品墊為經(jīng)過處理的纖維膜或玻璃棉，用于快速吸收待檢樣品，使其利用毛細(xì)管作用向結(jié)合墊方向側(cè)向流動。結(jié)合墊為纖維膜或玻璃棉，吸附有標(biāo)記的生物活性材料（如金標(biāo)抗體），它可與待檢樣品溶液里的檢測靶標(biāo)結(jié)合形成肉眼可見的免疫復(fù)合物。層析膜大都為硝酸纖維素（nitrocellulose，NC）膜，它是LFCA的關(guān)鍵材料，為分析物之間的反應(yīng)提供了平臺，其上固定有兩條或多條不同生物活性物質(zhì)（如抗原或抗體）噴印的“檢測（test，T）線”和“質(zhì)控（control，C）線”，用于攔截帶標(biāo)記的免疫復(fù)合物，并可直觀地顯示檢測結(jié)果。吸水墊為吸水紙板，用于吸收流過層析膜的待檢樣品，以平衡層析膜兩邊的壓差，促使更多待檢樣品在層析膜上側(cè)向流動。
LFCA是一項基于抗原抗體特異性結(jié)合或核酸探針和靶向核酸雜交反應(yīng)來檢測樣品中目標(biāo)物質(zhì)的有效技術(shù)。其中，當(dāng)抗體被用作生物識別因素時，LFCA又叫免疫層析試紙快速檢測技術(shù)。它是一種20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的將標(biāo)記免疫技術(shù)和色譜層析技術(shù)結(jié)合起來的固相膜免疫分析方法，依據(jù)其免疫層析反應(yīng)時抗原與抗體結(jié)合方式的不同，主要分為兩類，即雙抗體夾心免疫層析法和競爭免疫層析法。
02
基于抗體抗原結(jié)合的LFCA
** 雙抗體夾心免疫層析技術(shù)原理**
2.1
由于含有較多的抗原位點(diǎn)，雙抗體夾心法適用于檢測大分子物質(zhì)。該模式中使用了3 種抗體：第一種是被標(biāo)記材料標(biāo)記在結(jié)合墊上的將與樣品中抗原特異性結(jié)合的單克隆抗體1（monoclonal antibody 1，mAb1）；第二種是噴印在T線上的與不同抗原決定簇結(jié)合的捕獲單克隆抗體2（monoclonal antibody 2，mAb2）或多克隆抗體（polyclonal antibody，pAb）；第三種是被噴印在C線上的抗種屬特異性免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）的“抗抗體”。
以膠體金標(biāo)記法為例，其檢測原理如下：利用待測抗原上的兩個抗原決定簇A和B分別與結(jié)合墊上的金標(biāo)抗體和T線上的捕獲抗體結(jié)合，形成“金標(biāo)抗體（mAb1）-待測抗原-捕獲抗體（mAb2或pAb）”復(fù)合物；該復(fù)合物因為有膠體金的緣故而顯紅色，復(fù)合物的形成量與待測抗原含量成正比，C線將未被T線攔截的金標(biāo)抗體mAb1及部分抗原-金標(biāo)抗體復(fù)合物攔截并反應(yīng)顯色。于是，當(dāng)?shù)渭拥綐悠穳|上的待測樣品通過毛細(xì)管作用向前層析到結(jié)合墊上時，會溶解其上的金標(biāo)抗體并一同向前涌動：如果樣品中含有抗原，T線和C線均會顯現(xiàn)紅色；反之，T線無條帶，C線顯紅色（圖2）；C線不顯色則結(jié)果不能判斷。
** 競爭免疫層析法原理**
2.2
小分子不能同時結(jié)合兩種及兩種以上的抗體，而競爭法檢測模式為競爭抑制性的免疫學(xué)結(jié)合反應(yīng)，所以競爭法適用于抗原位點(diǎn)較少或僅有單個抗原位點(diǎn)的小分子化合物的檢測。該方法中使用了兩種抗體，一種是與樣品中抗原特異性結(jié)合的抗體，另一種是噴印在C線上的二抗。與雙抗體夾心法不同的是，競爭免疫層析法試紙條結(jié)果表現(xiàn)為：若樣品中無靶標(biāo)抗原，則T線和C線處均顯現(xiàn)條帶；反之，若樣品中有靶標(biāo)抗原，則C線處顯現(xiàn)條帶，T線處無條帶，T線條帶顏色深度與靶標(biāo)抗原含量成反比；C線不顯條帶則結(jié)果不能判斷。
競爭法分兩種模式，一種用于檢測抗原，另一種是當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去或不易得到足夠的純化抗原時，用來檢測特異性抗體。以膠體金標(biāo)記為例，在第一種檢測抗原的模式中，用膠體金標(biāo)記一定量的靶標(biāo)抗原并固定在結(jié)合墊上，T線與C線分別噴涂與靶標(biāo)抗原特異性結(jié)合的抗體（一抗）以及抗種屬特異性IgG的“抗抗體”：對于陰性樣品，金標(biāo)抗原隨樣品側(cè)向流動，在T線處與一抗結(jié)合，在C線處與二抗結(jié)合，結(jié)果T線和C線均顯現(xiàn)紅色；對于陽性樣品，樣品中未被標(biāo)記的靶標(biāo)抗原和結(jié)合墊上金標(biāo)的靶標(biāo)抗原通過競爭與T線處的一抗結(jié)合，樣品中的靶標(biāo)抗原越多，結(jié)合在T線上的金標(biāo)抗原越少，顯色也就越淺，而過量的金標(biāo)抗原與C線處的二抗結(jié)合，故只有C線顯現(xiàn)紅色（圖3）。
在第二種檢測抗體的模式中，將抗體用膠體金標(biāo)記在結(jié)合墊上，T線和C線分別包含抗原與載體分子（通常為牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA））的結(jié)合物以及抗種屬特異性IgG的“抗抗體”。樣品中的靶標(biāo)抗體和結(jié)合墊上的金標(biāo)抗體共同競爭T線上的抗原與載體分子的結(jié)合物：對于陰性樣品，結(jié)合墊上的金標(biāo)抗體分別與T線和C線上的固定物反應(yīng)結(jié)合，使T線和C線均顯現(xiàn)紅色；對于陽性樣品，樣品中的靶標(biāo)抗體會優(yōu)先和T線上的抗原與載體分子的結(jié)合物特異性結(jié)合，樣品中的靶標(biāo)抗體越多，結(jié)合在T線上的金標(biāo)抗體就越少，顯色也越淺，而過量的金標(biāo)抗體與C線處的二抗結(jié)合，故只有在C線處顯現(xiàn)紅色（圖4）。
03
基于核酸的LFCA
由于親和素和生物素間特異性強(qiáng)、親和力大、可分別結(jié)合各種大小分子而構(gòu)成親和素-生物素系統(tǒng)（avidinbiotin system，ABS），將核酸和LFCA結(jié)合起來。類似ABS，生物素-生物素抗體、生物素-鏈霉親和素、熒光素-熒光素抗體、地高辛-地高辛抗體等系統(tǒng)也具有這種橋梁連接作用。
基于此，互補(bǔ)的核苷酸序列（DNA與DNA、DNA與RNA、RNA與RNA等）通過Watson-Crick堿基配對形成非共價鍵，從而形成穩(wěn)定的同源或異源雙鏈分子的核酸雜交過程，核酸也可被用作LFCA的生物識別元件。檢測結(jié)果及分析如下：T線和C線均顯條帶者為陽性樣品；C線顯色而T線不顯色者為陰性樣品；C線不顯色則結(jié)果不能判斷。依據(jù)方法過程中是否需要抗體，基于核酸的LFCA中分為兩種類型，一種是抗體依賴型（又稱“核酸側(cè)流免疫（nucleic acid lateral flow immunoassay，NALFIA）”），另一種是抗體非依賴型（又稱“核酸側(cè)流檢測試紙條（nucleic acid lateral test strips，NALTS）”）。
** NALFIA技術(shù)**
3.1
抗體依賴型LFCA中運(yùn)用了核酸-抗體相互作用以及雙鏈DNA的特異性標(biāo)記，因此又被稱為NALFIA。NALFIA其實是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)與ELISA技術(shù)的結(jié)合應(yīng)用。以膠體金NALFIA為例：首先針對檢測靶標(biāo)特異性基因片段設(shè)計一對相應(yīng)的PCR引物，并對其進(jìn)行兩種不同標(biāo)記物標(biāo)記（如用生物素標(biāo)記一條引物，而用熒光素標(biāo)記另一條引物），通過PCR擴(kuò)增產(chǎn)生雙標(biāo)記的雙鏈擴(kuò)增產(chǎn)物；制作試紙條，在結(jié)合墊上固定一定量能與擴(kuò)增子標(biāo)記物之一特異性結(jié)合的物質(zhì)（如鏈霉親和素或親和素）和膠體金的復(fù)合物，T線噴涂特異性抗擴(kuò)增子另一標(biāo)記物的抗體的標(biāo)記物（如熒光素抗體），C線噴涂能與結(jié)合墊上復(fù)合物特異性結(jié)合的物質(zhì)（如生物素）；用制作的膠體金試紙條對PCR產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測。
對于陽性樣品，雙標(biāo)擴(kuò)增子由于毛細(xì)管作用力從樣品墊側(cè)流至結(jié)合墊，其上的生物素與結(jié)合墊上的鏈霉親和素或親和素特異性結(jié)合，復(fù)合物又側(cè)流至T線后，雙標(biāo)擴(kuò)增子上的熒光素與T線上的熒光素抗體特異性結(jié)合，結(jié)合墊上過量的鏈霉親和素或親和素又與C線上的生物素特異性結(jié)合，又因結(jié)合墊上鏈霉親和素或親和素被膠體金標(biāo)記，所以T線與C線同時顯紅色；對于陰性樣品，結(jié)合墊上的鏈霉親和素或親和素與C線上的生物素特異性結(jié)合，所以只有C線顯紅色；C線不顯色則結(jié)果不能判斷。
** NALTS技術(shù)**
3.2
抗體非依賴型LFCA因不依賴抗體而被稱作NALTS。與NALFIA不同的是，NALTS的被檢樣品是單鏈核苷酸而非雙鏈核苷酸，它的關(guān)鍵步驟是核酸雜交。核酸適配體是一小段經(jīng)體外篩選得到的人造短鏈單鏈寡核苷酸（RNA或DNA），它們能特異性識別并結(jié)合靶向核酸且易于合成，并且在標(biāo)記過程中不會失去活性，因此，核酸適配體常被用在NALTS中代替抗體發(fā)揮作用。以膠體金NALTS為例，結(jié)合墊上固定一定量被膠體金標(biāo)記的捕獲探針與標(biāo)記物（如生物素）的結(jié)合物，T線噴涂結(jié)合探針或其與BSA的結(jié)合物，C線噴涂與結(jié)合墊標(biāo)記物特異性結(jié)合的標(biāo)記物（如鏈霉親和素）。
對于陽性樣品，單鏈擴(kuò)增子與結(jié)合墊上的捕獲核酸探針雜交，復(fù)合物又與T線上的結(jié)合探針雜交，C線上的鏈霉親和素與結(jié)合墊上過量的生物素特異性結(jié)合，又因結(jié)合墊上捕獲探針與生物素被膠體金標(biāo)記，所以T線和C線同時顯紅色條帶；對于陰性樣品，C線上的鏈霉親和素與結(jié)合墊上的親和素特異性結(jié)合，所以只有C線顯紅色條帶；C線不顯色則結(jié)果不能判斷。
NALFIA和NALTS因檢測原理不同，檢測靈敏度和時間也有所不同。因為雜交過程比標(biāo)記物之間的親和反應(yīng)更耗費(fèi)時間，所以NALTS需要的檢測時間比NALFIA長；而靈敏度則與更多條件有關(guān)，無法給出統(tǒng)一結(jié)論。例如，赭曲霉毒素A是曲霉和青霉家族的次級代謝產(chǎn)物，它是一種小分子，適用于競爭性LFCA?；谶m配子和抗體的LFCA可用于赭曲霉毒素A的檢測?；贜ALTS的檢測限可達(dá)0.18 ng/mL，基于NALFIA的檢測限為0.5 ng/mL。
