1. A single-cell map for the transcriptomic signatures of peripheral blood mononuclear cells in end stage renal disease

這是今年剛發(fā)的一篇文章，影響因子5.991。因為是做PBMC的，來學習一下分析思路和亞群注釋的方法。

背景：終末期腎衰存在systemic inflammation和immune deficiency，但背后機制未知。
方法和結(jié)果：對10個正常對照HC和10個終末期腎衰ESRD的PBMC樣本進行了單細胞測序（是混樣送的，實際只送了兩個樣，真省錢）。HC樣本得到12981個細胞，ESRD樣本得到9578個細胞。分析結(jié)果顯示ESRD患者出現(xiàn)了免疫反應、補體級聯(lián)反應和細胞代謝的上調(diào)，細胞周期進程出現(xiàn)了下調(diào)。此外，還鑒定了一些驅(qū)動ESRD相關轉(zhuǎn)錄變化的細胞類型特異性轉(zhuǎn)錄因子。
結(jié)論：構建了ESRD患者PBMC的high-resolution map（一個樣本，九千多個細胞就敢說是high-resolution map？），結(jié)果揭示了細胞群特異的通路和轉(zhuǎn)錄因子。

這篇文章做的極為簡單，F(xiàn)ig 1對所有細胞做了注釋，F(xiàn)eaturePlot看了一下marker基因。Fig 2-4分別對單核細胞、NK和B、T細胞做了GSVA通路富集(用的hallmark pathway gene)和SCENIC轉(zhuǎn)錄因子預測。所用到的方法之前都寫過，見：通路富集和SCENIC。通路富集結(jié)果和轉(zhuǎn)錄因子預測結(jié)果的解讀只要能自圓其說即可。

重點來看下是怎么做的PBMC注釋吧

注釋了9個細胞亞群：

• 粒單系：樹突狀細胞 (Cluster 13; CD1C+)和單核細胞 (Clusters 5 和 8; CD68+，Cluster 5: CD14+，高表達S100A8 和 S100A9，是經(jīng)典單核；Cluster 8 高表達FCGR3A/CD16，是非經(jīng)典單核)
• 巨核系：巨核細胞(PF4+)
• 淋系：
  T：(Clusters 0, 1, 3, 4, 9 and 11; CD3D+)
  B (Clusters 6 和 12; MS4A1+)
  NK (Clusters 2 和 7; CD3D- ,NKG7+)

T細胞還做了亞群細分（四個亞群），但是沒有按CD4和CD8來分。別的都是直接用的大群。
TEM/TEMRA 細胞 (effector memory or terminally differentiated effector memory T cells)：高表達細胞毒性分子(GNLY 和FGFBP2) 和其他效應marker (CCL5, NKG7 和 KLRG1)
TN (naive T cells)：高表達CCR7和其他naive基因如LEF1
TCM (central memory T cells)：和TN一樣高表達IL7R, LEF1 和 CD27，但是和TN相比，低表達CCR7。高表達在TN中不表達的CCR6。
STMN1+T：高表達細胞周期相關基因STMN1，后續(xù)分析排除了這一群細胞。

附更全的T細胞marker參考表

2. Single-cell RNA sequencing reveals the sustained immune cell dysfunction in the pathogenesis of sepsis secondary to bacterial pneumonia

第二篇也是今年的文章，5.731分，做的繼發(fā)于細菌性肺炎的敗血癥患者外周血PBMC的單細胞測序。

Fig 1. 常規(guī)的圖譜展示

A：送樣流程。病例樣本來自兩個患者，患者1 取了stable和recovery期兩個樣本（Sta-1和Rec-1）?；颊?取了stable，acute和recovery三個樣本（Sta-2, Acu-2和Rec-2）。5個正常對照樣本中HC-1是作者自己送的，HC2-5來自于數(shù)據(jù)庫（是個省錢的辦法）。一共測得了52412個細胞。
B和C：umap圖分別以細胞群和樣本來源著色。B圖的細胞注釋直接分了三個大群T/NK細胞 (CD3D+ IL32+ NKG7+)，Myeloid細胞(CD14+ FCGR3A+ S100A9+)和B細胞(CD79B+ CD79A+ IGHM+)。??這樣將NK和T放在一起注釋是可以理解的，因為按道理來說NK和T的區(qū)別在于T細胞是CD3(CD3D, CD3E等)陽性的，而NK細胞是CD3陰性的，但事實上很多細胞都是NKG7(NK marker)和CD3同時高表達，在E圖中也可以看出來。
D：三個大群的通路富集。NK/T細胞主要富集到淋巴細胞活化和適應性免疫反應通路；髓系細胞主要富集到髓系白細胞活化、細胞因子介導的信號通路和對細菌的反應通路；B細胞主要富集到B細胞活化和增殖通路。
E：marker基因展示
F：HC和病例組三個時期細胞群比例展示。NK/T細胞比例持續(xù)下降，髓系細胞比例持續(xù)上升。提示免疫細胞比例失調(diào)在恢復期患者也持續(xù)存在。

Fig 2. 細菌性肺炎繼發(fā)敗血癥的病理生理過程中干擾素反應和TNFA信號通路上調(diào)

因為測了時間點，所以這個fig主要是對不同時間點進行了分析（不管什么細胞，相當于bulk RNAseq）。

A, B和C：急性期、穩(wěn)定期和恢復期分別和HC相比的差異基因的通路富集。差異基因是用Seurat用的FindMarker()做的，差異基因篩選標準：Adjusted p < 0.05 & |log2FC| > 0.25。隨后用fgsea(nperm = 1, minSize = 1, maxSize = 500)做的GSEA通路富集（significant hallmark gene sets）。P < 0.05的通路為顯著富集。結(jié)果提示和HC相比，病程三個時間點都出現(xiàn)了IFN-r反應的上調(diào)。此外急性期和恢復期還出現(xiàn)了NFkB介導的TNFa通路的上調(diào)。
D圖：在ABC圖的基礎上查看了IFN-r反應和NFkB介導的TNFa信號通路基因在四個時間點的表達，確實出現(xiàn)了上調(diào)。（這里NFkB介導的TNFa通路在三個時期都出現(xiàn)了上調(diào)）
E和F：為了探究這兩個在病程中持續(xù)存在的通路活化是哪種細胞介導的，做了三種免疫細胞群的GSEA通路富集。發(fā)現(xiàn)NK/T細胞在病程中所有階段都出現(xiàn)了IFN-r反應上調(diào)，而髓系細胞在急性和恢復期出現(xiàn)了NFkB介導的TNFa信號通路反應上調(diào)（和圖ABC對應）

G圖：查看了疾病過程中基因表達的動態(tài)轉(zhuǎn)錄變化，發(fā)現(xiàn)了8個不同的時間依賴性表達模式，并評估了每個模式的功能。這部分是用TCseq做的。用法之前寫過，見：TCseq：基因表達趨勢分析。

Fig 3. 細菌性肺炎繼發(fā)敗血癥患者的T細胞和NK細胞存在持續(xù)的耗竭和凋亡特征

A圖：對NK/T細胞進行了亞群細分，得到了10個亞群。
NK(FGFBP2+ NKG7+)
NKT(CD3D+ NCR3+)
Pro-T(MKI67+ STMN1+)
CD4T(CD3D+ CD4+): CD4 Tn(CD4+ CCR7+), CD4 Tpm(LTB+ IL7R+), CD4+CD28+T(CD4+ CD28+), Treg(IL2RA+ FOXP3+)
CD8T(CD3D+ CD8A+ CD8B+): CD8Tn(CD8A+ CCR7+), CD8Te(CCL5+ GZMB+), CD8Tem(GZMA+ GZMK+).

B圖：10個亞群的marker基因小提琴圖展示
C圖：10個亞群的功能富集
D圖：既往文獻報道sepsis患者的免疫抑制狀態(tài)主要與淋巴細胞尤其是T細胞的耗竭有關。所以D圖查看了T細胞耗竭(PRDM1和 LAG3)、凋亡(TNFSF10, TNFRSF1B, BCL2L11 和CASP3)和激活(CD69)相關基因在三種細胞群中表達的點圖。結(jié)果顯示患者T細胞激活增強，除了CD4+CD28+T細胞以外，其他細胞耗竭和凋亡marker表達也增加。恢復期各種細胞也高表達耗竭和凋亡的marker，說明雖然癥狀恢復了，免疫細胞的紊亂并沒有恢復。（??可以借鑒）
??這個點圖的畫法可以通過將細胞類型和病程信息貼在一起存在一個新的metadata，再繪制點圖即可（堆疊點圖）。
E圖：不同病程時間點NK/T細胞亞群的比例變化。CD4+ Tn 和CD8+ Tn減少，提示免疫抑制。CD8+ Te和CD8+ Tem增多，提示淋巴細胞活性增強。CD8+ Te和CD8+Tem在急性期增加，穩(wěn)定期下降，恢復期再次增加。NK細胞在HC和急性期比例差不多，穩(wěn)定期和恢復期持續(xù)增加。
F圖：為了進一步探究NK細胞功能，提取了NK細胞，調(diào)整resolution進行了再聚類。得到了兩個NK細胞群。
G圖：兩個NK細胞群的功能富集
H圖：兩個NK細胞群比例變化

Fig 4. 髓系細胞的紊亂主要存在于恢復期

A圖：對髓系細胞群進行了細分，得到8個亞群。
巨核細胞 (MK, PF4+ PPBP+)
樹突狀細胞(DC, JCHAIN+ SEC11C+)
單核細胞(CD14+ /FCGR3A+)：CD14⁺ Mono1(CD14+ CPVL+), CD14⁺ Mono2 (S100A8+ VCAN+), CD16⁺ Mono (FCGR3A+ MS4A7+), HLA-DR⁺ Mono(HLA-DR+ CD74+), CD24⁺ Mono(CD24+ CAMP+) 和LDHB⁺ Mono(LDHB+ STMN1+) 。
單核一般是按CD14和CD16來劃分的，后面幾個群是作者自己定義的。這些邊角小群定義起來很麻煩，也有可能是雙細胞。總而言之，單細胞亞群定義沒有統(tǒng)一規(guī)則，言之有理即可。
B圖：8個亞群的marker基因小提琴圖展示
C圖：8個亞群的功能富集
D圖：8個亞群的比例變化。CD24+Mono只在恢復期出現(xiàn)，作者認為是一種新的細胞群
E圖：分析了一下和HC相比，恢復期髓系細胞的通路富集，結(jié)果提示激活的免疫反應在已經(jīng)恢復患者的髓系細胞中也存在。

Fig 5.細菌性肺炎繼發(fā)敗血癥患者外周血漿細胞出現(xiàn)擴增

A圖：對B細胞進行了細分，得到3個亞群。
Bn (TCL1A, IGHD 和 IL4R)
Bm (AIM2, TNFRSF13B 和 CD27)
漿細胞 (MZB1, IGHG3 和 JCHAIN)
這部分B細胞的注釋還結(jié)合了功能富集的結(jié)果
B圖：3個亞群的marker基因小提琴圖展示
C圖：3個亞群的功能富集（結(jié)合功能富集結(jié)果幫助細胞亞群注釋）
D圖：3個亞群的比例變化。漿細胞在急性期出現(xiàn)，穩(wěn)定期進一步增加，恢復期減少。
因此進一步想要去探究漿細胞在急性期和穩(wěn)定期擴增的機制
由于在前面NK細胞功能富集Fig3C中，富集通路結(jié)果顯示NK細胞與B細胞增殖，白細胞活化和正向調(diào)控凋亡反應相關，所以想要進一步去探究NK細胞和漿細胞擴增的關系。（這個邏輯有點牽強）
E圖：HLA-DRA的表達和病程中漿細胞擴增的動態(tài)變化相平行（？？牽強）
F圖：做了個細胞互作，目的在于說明NK細胞和B細胞的互作對漿細胞的擴增很重要。（牽強）

Fig 6. 單核細胞可能通過IL1B信號通路來促進T細胞的擴增和耗竭

細菌性肺炎繼發(fā)敗血癥患者的外周血T細胞呈現(xiàn)免疫活化和抑制的狀態(tài)。既往文獻報道各種單核細胞亞群可能參與了T細胞的活化和凋亡，因此這部分使用NitchNetR分析了單核細胞和T細胞之間的互作。

研究活化：
挑選的sender細胞：CD14+ Mono2, CD16+ Mono, CD24+ Mono, HLA-DR+ Mono 和 LDHB+ Mono(Fig4C顯示這些細胞與T細胞活化高度相關)
挑選的receiver細胞：CD8+ Te (A圖) 和 CD??8+ Tem (B圖) （這兩個細胞群在病程中比例持續(xù)增加）
A, B圖：結(jié)果顯示兩種活化相關的互作在恢復期比較集中，急性期則比較稀疏（急性期的圖在supplement）
C圖：top predicted ligand中，IL1B是所有挑選的sender單核細胞都表達的，對兩種receiver T細胞都起到調(diào)控作用。100A9, JUN 和 S100A8是IL1B對這兩種receiver T進行調(diào)控的主要靶點。SPl1, RELA, FOS, EP300, STAT3, IRAK1 和 M??C等分子是IL1B對其靶基因進行調(diào)控的transcriptional regulators。

研究抑制：
挑選的sender細胞：CD14+ Mono2, CD16+ Mono （Fig4C顯示這兩個細胞群功能與細胞死亡調(diào)控、凋亡、負性調(diào)節(jié)細胞增殖及負性調(diào)節(jié)免疫反應相關）
挑選的receiver細胞：CD4+ Tn (D圖) 和CD8+ Tn (E圖) （在病程中持續(xù)下降）
D, E圖：結(jié)果顯示這些sender細胞對CD4+ Tn的調(diào)控在急性期比較集中，而和CD8+ Tn的互作在各個時期均有發(fā)生。
F圖：top predicted ligand中，IL1B是所有挑選的sender單核細胞都表達的，對兩種receiver T細胞都起到調(diào)控作用。并展示了其靶基因和中間regulator。

因此IL1B可以通過在不同時期作用于不同的靶基因參與到T細胞增殖和耗竭的調(diào)控

Fig 7. 細菌性肺炎繼發(fā)敗血癥患者和流感性肺炎、SARS-CoV2肺炎繼發(fā)的敗血癥存在不同的免疫反應

近期有研究顯示病毒和SARS-CoV2引起的敗血癥在器官功能失調(diào)、預后、T細胞數(shù)目和亞型比例上均有區(qū)別，但是它們在免疫反應上的區(qū)別并不明確。
因此作者從數(shù)據(jù)庫中下載了一組新冠引起的敗血癥性休克數(shù)據(jù)、一組新冠引起的多器官衰竭數(shù)據(jù)、一組繼發(fā)于流感性肺炎的敗血癥數(shù)據(jù)、一組細菌性肺炎繼發(fā)的敗血癥數(shù)據(jù)和作者自己的細菌性肺炎繼發(fā)的敗血癥數(shù)據(jù)，五組數(shù)據(jù)進行了綜合分析。
A圖：一些干擾素相關基因在五組數(shù)據(jù)中的表達
B圖：五組數(shù)據(jù)細胞構成差異
C圖：五組數(shù)據(jù)細胞比例變化
D圖：SARS和病毒性肺炎敗血癥相比IFNr通路富集情況
E圖：五組數(shù)據(jù)中T細胞亞群凋亡和耗竭相關基因的表達

這篇文章已經(jīng)做的比較全面了，思路還算清晰，分析數(shù)據(jù)量也很大，只發(fā)了5分大概是因為有人發(fā)的更早。
此外這片文獻的method里提到了用于Supervised cell type annotation的SciBet包，之前沒有用過，查了一下是張澤民老師開發(fā)的，值得學習。