重疊配對(duì)末端讀數(shù)由FLASH（v1.2.11）組裝[36]。具有97%相似性的序列在USEARCH（v7.0.1090）管道[38]中與UPARSE[37]聚類成操作分類單位（OTU）。SILV A數(shù)據(jù)庫（v132）用于分類學(xué)分配[39]。過濾掉分類為線粒體或葉綠體的OTU，并使用QIIME（single_rarefication.py）通過稀釋至最小序列深度將豐度標(biāo)準(zhǔn)化。通過QIIME估算α多樣性（α多樣性），以評(píng)估樣本中物種的復(fù)雜性，包括觀測物種，Chao1，Shannon，Simpson，基于豐度的覆蓋估計(jì)（ACE）和系統(tǒng)發(fā)育多樣性指數(shù)（PD_whole_tree）[40]。使用QIIME和R腳本（v3.3.1），使用Bray-Curtis距離矩陣進(jìn)行Beta多樣性（β多樣性）分析。PERMANOV A用于評(píng)估使用R包“vegan”中的“adonis”函數(shù)的數(shù)據(jù)集之間的差異[41]。通過使用R軟件中的“factoextra”和“ggplot2”包對(duì)過濾的OTU表的相對(duì)豐度進(jìn)行主成分分析（PCA）。使用所有樣品的Bray-Curtis距離和環(huán)境因素的歐幾里得距離在R包“vegan”中進(jìn)行Mantel測試以評(píng)估細(xì)菌群落和環(huán)境因素之間的相關(guān)性，并且通過Spearman與9999個(gè)排列的相關(guān)性進(jìn)一步測試。然后，使用典型相關(guān)分析（CCA）來證明使用R中的“phyloseq”和“microbiome”包的相關(guān)性。為了識(shí)別響應(yīng)于生長階段或田間管理的指示物種，在R中使用“multipatt”。進(jìn)行“indispecies”包以測試OTU豐度與這些變量之間的相關(guān)性。然后，使用R包“edgeR”中的“glmLRT”函數(shù)進(jìn)行似然比檢驗(yàn)，以測試OTU對(duì)生長階段或現(xiàn)場管理的敏感性。對(duì)于宏基因組數(shù)據(jù)的功能組成，PICRUSt（v1.1.1）[42]基于Greengenes系統(tǒng)發(fā)育[43]進(jìn)行，功能使用KEGG（京都基因和基因組百科全書）Orthology進(jìn)行分類[44]。使用R中的“ComplexHeatmap”軟件包生成了一個(gè)由歐幾里得距離聚類的熱圖，以顯示預(yù)測的基因功能的強(qiáng)度。
使用R“stats”軟件包（v4.0.2）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果在p<0.05時(shí)被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)用帶有Dunn多重比較事后檢驗(yàn)的Kruskal–Wallis檢驗(yàn)來評(píng)估組之間α多樣性指數(shù)的方差。使用STAMP（v2.1.3）通過Welch's t檢驗(yàn)評(píng)估組間細(xì)菌豐度的差異[45]。
圖3。典型對(duì)應(yīng)分析（CCA）排序圖顯示了第一（A）和第二（B）作物季節(jié)水稻根細(xì)菌群落組成與環(huán)境變量之間的相關(guān)性。數(shù)據(jù)點(diǎn)由樣本著色。圓形和三角形分別表示來自常規(guī)場和有機(jī)場的樣品。僅顯示通過邊際測試評(píng)估時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的環(huán)境變量。箭頭的方向和長度表示與其他變量相比，陡度增加和變量強(qiáng)度。EC：土壤電導(dǎo)率；組織。mat：土壤有機(jī)質(zhì)含量；和pH：土壤pH。
總之，我們在連續(xù)兩個(gè)作物季節(jié)的幼苗和分蘗生長階段研究了常規(guī)和有機(jī)稻田中的水稻根系內(nèi)生微生物組。我們的研究表明植物生長階段，田間管理系統(tǒng)以及這兩個(gè)因素之間的相互作用對(duì)水稻根系內(nèi)生細(xì)菌群落組成的顯著影響，但對(duì)其α-多樣性沒有影響。在這些因素中，生長階段在塑造根微生物組中起著最重要的作用。我們還發(fā)現(xiàn)土壤pH和有機(jī)質(zhì)含量影響根微生物組。此外，我們根據(jù)植物生長階段和田間管理系統(tǒng)確定了潛在的指示物種。本研究展示了不同耕作制度下水稻根系微生物組隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化，為微生物組管理提供了新的見解。需要進(jìn)一步的研究來揭示和操縱微生物組的功能，以提高農(nóng)業(yè)系統(tǒng)的可持續(xù)性。
