- 1.CellChat對象的創(chuàng)建、處理及初始化
- 2.細(xì)胞通信網(wǎng)絡(luò)推斷
- 3. 細(xì)胞通信網(wǎng)絡(luò)的可視化
- 4. 細(xì)胞通信網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)分析
- 5. 保存cellchat對象
細(xì)胞通訊分析可以提供細(xì)胞亞群互調(diào)控的信息，細(xì)胞間的調(diào)控主要是通過受體配體結(jié)合來實(shí)現(xiàn)信號(hào)傳遞的。
這里使用CellChat對單個(gè)單細(xì)胞數(shù)據(jù)集進(jìn)行細(xì)胞間通訊分析
1.CellChat對象的創(chuàng)建、處理及初始化
創(chuàng)建CellChat對象需要兩個(gè)文件：1.細(xì)胞的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，可以直接是Seurat 或者 SingleCellExperiment 對象；2.用戶分配的細(xì)胞標(biāo)簽（即基于標(biāo)簽的模式）或單細(xì)胞數(shù)據(jù)的低維表示（即無標(biāo)簽?zāi)Ｊ剑?。對于后者，CellChat 通過根據(jù)低維空間或偽時(shí)間軌跡空間中的細(xì)胞距離構(gòu)建共享的鄰近圖自動(dòng)對細(xì)胞進(jìn)行分組。
1.1 使用Seurat對象創(chuàng)建CellChat對象
#加載包
library(CellChat)
library(ggplot2)
library(ggalluvial)
library(svglite)
library(Seurat)
library(SeuratData)
options(stringsAsFactors = FALSE)
#加載之前跑完Seurat標(biāo)準(zhǔn)流程的數(shù)據(jù)
load(file = 'sce-monocyte.Rdata')
cellchat<-createCellChat(sce)
str(cellchat)
[1] "Formal class 'CellChat' [package \"CellChat\"] with 14 slots"
[2] " ..@ data.raw : num[0 , 0 ] "
[3] " ..@ data :Formal class 'dgCMatrix' [package \"Matrix\"] with 6 slots"
[4] " .. .. ..@ i : int [1:615321] 11 26 33 43 52 57 73 98 130 142 ..."
[5] " .. .. ..@ p : int [1:643] 0 960 1510 2568 3990 4867 6408 7776 8793 9810 ..."
[6] " .. .. ..@ Dim : int [1:2] 13714 642"
[7] " .. .. ..@ Dimnames:List of 2"
[8] " .. .. .. ..$ : chr [1:13714] \"AL627309.1\" \"AP006222.2\" \"RP11-206L10.2\" \"RP11-206L10.9\" ..."
[9] " .. .. .. ..$ : chr [1:642] \"AAACCGTGCTTCCG-1\" \"AAACGCTGTTTCTG-1\" \"AAAGAGACGCGAGA-1\" \"AAAGCAGATATCGG-1\" ..."
[10] " .. .. ..@ x : num [1:615321] 3.56 1.57 2.52 1.57 1.57 ..."
[11] " .. .. ..@ factors : list()"
[12] " ..@ data.signaling: num[0 , 0 ] "
[13] " ..@ data.scale : num[0 , 0 ] "
[14] " ..@ data.project : num[0 , 0 ] "
[15] " ..@ net : list()"
[16] " ..@ netP : list()"
[17] " ..@ meta :'data.frame':\t642 obs. of 7 variables:"
[18] " .. ..$ orig.ident : Factor w/ 1 level \"pbmc3k\": 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ..."
[19] " .. ..$ nCount_RNA : num [1:642] 2639 1103 3033 4584 2683 ..."
[20] " .. ..$ nFeature_RNA : int [1:642] 960 550 1058 1422 877 1541 1368 1017 1017 822 ..."
[21] " .. ..$ percent.mt : num [1:642] 1.74 2.9 1.42 1.4 2.5 ..."
[22] " .. ..$ RNA_snn_res.0.5: Factor w/ 9 levels \"0\",\"1\",\"2\",\"3\",..: 2 6 2 2 2 6 6 2 2 2 ..."
[23] " .. ..$ seurat_clusters: Factor w/ 9 levels \"0\",\"1\",\"2\",\"3\",..: 2 6 2 2 2 6 6 2 2 2 ..."
[24] " .. ..$ ident : Factor w/ 2 levels \"CD14+ Mono\",\"FCGR3A+ Mono\": 1 2 1 1 1 2 2 1 1 1 ..."
[25] " ..@ idents : Factor w/ 2 levels \"CD14+ Mono\",\"FCGR3A+ Mono\": 1 2 1 1 1 2 2 1 1 1 ..."
[26] " ..@ DB : list()"
[27] " ..@ LR : list()"
[28] " ..@ var.features : list()"
[29] " ..@ dr : list()"
[30] " ..@ options :List of 1"
[31] " .. ..$ mode: chr \"single\""
1.2 使用表達(dá)矩陣創(chuàng)建CellChat對象
# 加載scRNA-seq 數(shù)據(jù)矩陣及其meta數(shù)據(jù)
load(url("https://ndownloader.figshare.com/files/25950872")) # 該數(shù)據(jù)集包含兩組: 正常組和疾病組
data.input = data_humanSkin$data # 標(biāo)準(zhǔn)化過的矩陣
meta = data_humanSkin$meta
cell.use = rownames(meta)[meta$condition == "LS"] # 從疾病組中提取細(xì)胞名
# 整理數(shù)據(jù)：將疾病組單細(xì)胞數(shù)據(jù)提取出來
data.input = data.input[, cell.use]
meta = meta[cell.use, ]
# meta = data.frame(labels = meta$labels[cell.use], row.names = colnames(data.input)) # 手動(dòng)創(chuàng)建包含細(xì)胞labels的數(shù)據(jù)框
unique(meta$labels) # check the cell labels
cellchat <- createCellChat(object = data.input, meta = meta, group.by = "labels")
#從表達(dá)矩陣創(chuàng)建CellChat對象
#添加亞群信息
cellchat <- addMeta(cellchat, meta = meta)
cellchat <- setIdent(cellchat, ident.use = "labels")
levels(cellchat@idents)
groupSize <- as.numeric(table(cellchat@idents)) # 每個(gè)亞群細(xì)胞數(shù)
1.3 設(shè)置配體受體交互數(shù)據(jù)庫
CellChatDB 是一個(gè)手動(dòng)整理的文獻(xiàn)支持的配體受體在人和小鼠中的交互數(shù)據(jù)庫。小鼠中的CellChatDB包含2021個(gè)經(jīng)驗(yàn)證的分子相互作用，包括60%的自分泌/旁分泌信號(hào)相互作用、21%的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）受體相互作用和19%的細(xì)胞-細(xì)胞接觸相互作用。人的CellChatDB包含1939個(gè)經(jīng)驗(yàn)證的分子相互作用，包括61.8%的自分泌/旁分泌信號(hào)相互作用、21.7%的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）受體相互作用和16.5%的細(xì)胞-細(xì)胞接觸相互作用。
CellChatDB <- CellChatDB.human
# 如果是小鼠數(shù)據(jù)，使用CellChatDB.mouse
showDatabaseCategory(CellChatDB)
#查看下數(shù)據(jù)庫結(jié)構(gòu)
dplyr::glimpse(CellChatDB$interaction)
Rows: 1,939
Columns: 11
$ interaction_name <chr> "TGFB1_TGFBR1_TGFBR2", "TG…
$ pathway_name <chr> "TGFb", "TGFb", "TGFb", "T…
$ ligand <chr> "TGFB1", "TGFB2", "TGFB3",…
$ receptor <chr> "TGFbR1_R2", "TGFbR1_R2", …
$ agonist <chr> "TGFb agonist", "TGFb agon…
$ antagonist <chr> "TGFb antagonist", "TGFb a…
$ co_A_receptor <chr> "", "", "", "", "", "", ""…
$ co_I_receptor <chr> "TGFb inhibition receptor"…
$ evidence <chr> "KEGG: hsa04350", "KEGG: h…
$ annotation <chr> "Secreted Signaling", "Sec…
$ interaction_name_2 <chr> "TGFB1 - (TGFBR1+TGFBR2)",…
# 使用數(shù)據(jù)庫中的自分泌/旁分泌信號(hào)相互作用部分進(jìn)行后續(xù)分析，可根據(jù)試驗(yàn)方案、目的選擇
CellChatDB.use <- subsetDB(CellChatDB, search = "Secreted Signaling")
# 使用數(shù)據(jù)庫所有內(nèi)容進(jìn)行分析
# CellChatDB.use <- CellChatDB
# 在cellchat對象中設(shè)置使用的數(shù)據(jù)庫
cellchat@DB <- CellChatDB.use
1.4 表達(dá)數(shù)據(jù)的預(yù)處理
為了推斷細(xì)胞的通訊狀態(tài)，首先識(shí)別一個(gè)細(xì)胞組中過度表達(dá)的配體或受體，然后識(shí)別過度表達(dá)的配體受體相互作用。
還可以將基因表達(dá)數(shù)據(jù)投影到蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用 （PPI） 網(wǎng)絡(luò)上。投影過程根據(jù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)中定義的基因表達(dá)值來平滑基因的表達(dá)值。此功能在分析具有淺測序深度的單細(xì)胞數(shù)據(jù)時(shí)很有用，因?yàn)橥队翱蓽p少信號(hào)基因的dropput效應(yīng)，特別是對于配體/受體的可能的零表達(dá)。用戶可以通過在computeCommunProb()中設(shè)置raw.use = TRUE跳過此步驟。
cellchat <- subsetData(cellchat)
# subset the expression data of signaling genes for saving computation cost
#設(shè)置并行運(yùn)算
future::plan("multicore", workers = 40)
#識(shí)別細(xì)胞組中過度表達(dá)的配體或受體
cellchat <- identifyOverExpressedGenes(cellchat)
#識(shí)別過度表達(dá)的配體受體相互作用
cellchat <- identifyOverExpressedInteractions(cellchat)
#將基因表達(dá)數(shù)據(jù)投射到PPI網(wǎng)絡(luò)上
cellchat <- projectData(cellchat, PPI.human)
2.細(xì)胞通信網(wǎng)絡(luò)推斷
CellChat 通過將基因表達(dá)與先前已知的信號(hào)配體、受體及其同因子之間的相互作用知識(shí)相結(jié)合，利用大量作用規(guī)律，對細(xì)胞-細(xì)胞通信的概率進(jìn)行模擬。為每個(gè)相互作用分配一個(gè)概率值并進(jìn)行置換檢驗(yàn)，來推斷具有生物學(xué)意義的細(xì)胞-細(xì)胞通信。
推斷的配體受體對的數(shù)量顯然取決于計(jì)算每個(gè)細(xì)胞組平均基因表達(dá)的方法。默認(rèn)情況下，CellChat 使用一種統(tǒng)計(jì)學(xué)上強(qiáng)大的均值方法，稱為"trimean"，與其他方法相比，它產(chǎn)生的相互作用更少。然而，我們發(fā)現(xiàn) CellChat 在預(yù)測更強(qiáng)的交互方面表現(xiàn)良好，這非常有助于縮小交互范圍，以便進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。在computeCommunProb中，我們提供了一個(gè)選項(xiàng)，用于使用其他方法，如5%和10%截?cái)嗑?，來?jì)算平均基因表達(dá)。值得注意的是，"trimean"大約是25%的截?cái)嗥骄?，這意味著如果一組表達(dá)細(xì)胞的百分比低于25%，則平均基因表達(dá)為零。要使用 10% 截?cái)嗟钠骄?，用戶可以設(shè)置type = "truncatedMean"和對trim = 0.1。
在分析未分類的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組時(shí)，假設(shè)豐富的細(xì)胞群傾向于發(fā)送比稀有細(xì)胞群更強(qiáng)的信號(hào)，CellChat 還可以在概率計(jì)算中考慮每個(gè)細(xì)胞組中細(xì)胞比例的影響。用戶可以設(shè)置population.size = TRUE
2.1 計(jì)算通信概率并推斷cellchat網(wǎng)絡(luò)
cellchat <- computeCommunProb(cellchat, raw.use = TRUE)
# 如果在某些細(xì)胞群中只有少數(shù)細(xì)胞，則過濾掉細(xì)胞間的通信
cellchat <- filterCommunication(cellchat, min.cells = 10)
2.2 提取推斷的cellchat網(wǎng)絡(luò)作為數(shù)據(jù)框架
我們提供一個(gè)函數(shù)subsetCommunication，以輕松訪問推斷感興趣的細(xì)胞-細(xì)胞通信。例如
df.net <- subsetCommunication(cellchat)返回一個(gè)數(shù)據(jù)框架，該數(shù)據(jù)框架由配體/受體級(jí)別的所有推斷細(xì)胞通信組成。設(shè)置slot.name = "netP"可以在信號(hào)通路級(jí)別訪問推斷的通信
df.net <- subsetCommunication(cellchat, sources.use = c(1,2), targets.use = c(4,5))將推斷的細(xì)胞-細(xì)胞通信從細(xì)胞組1和2發(fā)送到細(xì)胞組4和5。
df.net <- subsetCommunication(cellchat, signaling = c("WNT", "TGFb"))通過向WNT和TGFb發(fā)出信號(hào)來調(diào)節(jié)推斷的細(xì)胞通信。
2.3 在信號(hào)通路級(jí)別推斷細(xì)胞-細(xì)胞通信
CellChat 通過總結(jié)與每個(gè)信號(hào)通路相關(guān)的所有配體-受體相互作用的通訊概率，來計(jì)算信號(hào)通路級(jí)別上的通訊概率。
每個(gè)配體受體對和每個(gè)信號(hào)通路的推斷細(xì)胞間通信網(wǎng)絡(luò)分別存儲(chǔ)在插槽"net"和"netP"中。
cellchat <- computeCommunProbPathway(cellchat)
2.4 計(jì)算整合的細(xì)胞通信網(wǎng)絡(luò)
通過計(jì)算鏈接數(shù)或匯總通信概率來計(jì)算通信網(wǎng)絡(luò)
cellchat <- aggregateNet(cellchat)
可視化整合的細(xì)胞通信網(wǎng)絡(luò)。 使用圓圖顯示任意兩個(gè)細(xì)胞組之間的相互作用次數(shù)或總交互強(qiáng)度（比重）。
groupSize <- as.numeric(table(cellchat@idents))
par(mfrow = c(1,2), xpd=TRUE)
netVisual_circle(cellchat@net$count, vertex.weight = groupSize, weight.scale = T, label.edge= F, title.name = "Number of interactions")
netVisual_circle(cellchat@net$weight, vertex.weight = groupSize, weight.scale = T, label.edge= F, title.name = "Interaction weights/strength")
由于細(xì)胞通信網(wǎng)絡(luò)較為復(fù)雜，我們可以檢查每個(gè)細(xì)胞組發(fā)送的信號(hào)。在這里，我們還控制參數(shù)edge.weight.max，以便我們可以比較不同網(wǎng)絡(luò)之間的邊緣權(quán)重。
mat <- cellchat@net$weight
par(mfrow = c(3,4), xpd=TRUE)
for (i in 1:nrow(mat)) {
mat2 <- matrix(0, nrow = nrow(mat), ncol = ncol(mat), dimnames = dimnames(mat))
mat2[i, ] <- mat[i, ]
netVisual_circle(mat2, vertex.weight = groupSize, weight.scale = T, edge.weight.max = max(mat), title.name = rownames(mat)[i])
}
3. 細(xì)胞通信網(wǎng)絡(luò)的可視化
CellChat提供了幾種可視化細(xì)胞通信網(wǎng)絡(luò)的方法，包括分層圖、圓圖、和弦圖和氣泡圖。還提供了一個(gè)易于使用的工具，用于提取和可視化推斷網(wǎng)絡(luò)的高階信息。例如，它允許對細(xì)胞群的主要信號(hào)輸入和輸出以及這些群和信號(hào)如何協(xié)調(diào)功能進(jìn)行現(xiàn)成預(yù)測。CellChat可以通過結(jié)合通訊網(wǎng)絡(luò)分析、模式識(shí)別和多重學(xué)習(xí)方法，使用綜合方法對推斷出的細(xì)胞-細(xì)胞通信網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行定量表征和比較。
3.1 使用層次結(jié)構(gòu)圖、圓圖或和弦圖可視化每個(gè)信號(hào)通路
層次結(jié)構(gòu)圖： 用戶應(yīng)定義vertex.receiver，這是一個(gè)數(shù)字矢量，將細(xì)胞群的索引作為層次圖左側(cè)的目標(biāo)。此分層圖由兩個(gè)部分組成：左部分顯示自分泌和旁分泌向某些感興趣的細(xì)胞組（即定義的）發(fā)出信號(hào)，右部分顯示自分泌和旁分泌向數(shù)據(jù)集中剩余的細(xì)胞組發(fā)出信號(hào)。因此，層級(jí)圖提供了一種信息性和直觀的方式來可視化自分泌和旁分泌信號(hào)之間的細(xì)胞群之間的感興趣通信。例如，在研究成纖維細(xì)胞和免疫細(xì)胞之間的細(xì)胞-細(xì)胞通信時(shí)，用戶可以定義為所有成纖維細(xì)胞組。
和弦圖： CellChat 提供兩種功能netVisual_chord_cell和netVisual_chord_gene，并可視化具有不同目的和不同級(jí)別的細(xì)胞通信。netVisual_chord_cell用于可視化不同細(xì)胞群之間的細(xì)胞-細(xì)胞通信（和弦圖中的每個(gè)部分是細(xì)胞組），netVisual_chord_gene用于可視化由多個(gè)配體受體或信號(hào)通路調(diào)節(jié)的細(xì)胞-細(xì)胞通信（和弦圖中的每個(gè)部分都是配體、受體或信號(hào)通路）。
邊緣顏色/權(quán)重、節(jié)點(diǎn)顏色/大小/形狀的解釋： 在所有可視化圖中，邊緣顏色與發(fā)送者源一致，邊緣權(quán)重與交互強(qiáng)度成正比。較厚的邊緣線表示信號(hào)更強(qiáng)。在層次結(jié)構(gòu)圖和圓圖中，圓的大小與每個(gè)細(xì)胞組中的細(xì)胞數(shù)量成正比。在層次圖中，實(shí)心和開放的圓分別代表源和目標(biāo)。在和弦圖中，內(nèi)條顏色表示從相應(yīng)的外條接收信號(hào)的目標(biāo)。內(nèi)條大小與目標(biāo)接收的信號(hào)強(qiáng)度成正比。這種內(nèi)條有助于解釋復(fù)雜的和弦圖。請注意，有一些內(nèi)條沒有與任何一些細(xì)胞組鏈接，請忽略它，因?yàn)檫@是一個(gè)本包尚未解決的問題。
不同層次的細(xì)胞通信可視化： 可以使用netVisual_aggregate可視化信號(hào)通路的推斷通信網(wǎng)絡(luò)，并使用netVisual_individual可視化與該信號(hào)通路相關(guān)的單個(gè)L-R對的推斷通信網(wǎng)絡(luò)。
以輸入一個(gè)信號(hào)通路為例。所有顯示重要通信的信號(hào)通路均可通過cellchat@netP$pathways獲取。
pathways.show <- c("CXCL")
netVisual_aggregate(cellchat, signaling = pathways.show)
# 和弦圖
par(mfrow=c(1,1))
netVisual_chord_cell(cellchat, signaling = pathways.show, title.name = paste0(pathways.show, " signaling network"))
# 熱圖
par(mfrow=c(1,1))
netVisual_heatmap(cellchat, signaling = pathways.show, color.heatmap = "Reds")
3.2 計(jì)算每個(gè)配體受體對整體信號(hào)通路的貢獻(xiàn)，并可視化由單個(gè)配體受體對調(diào)節(jié)的細(xì)胞通信
netAnalysis_contribution(cellchat, signaling = pathways.show)
還可以可視化由單個(gè)配體受體對調(diào)節(jié)的細(xì)胞-細(xì)胞通信。函數(shù)extractEnrichedLR來提取給定信號(hào)通路的所有重要相互作用（L-R對）和相關(guān)信號(hào)基因。
pairLR.CXCL <- extractEnrichedLR(cellchat, signaling = pathways.show, geneLR.return = FALSE)
LR.show <- pairLR.CXCL[1,] # show one ligand-receptor pair
netVisual_individual(cellchat, signaling = pathways.show, pairLR.use = LR.show)
#同樣可以用熱圖（netVisual_heatmap）和和弦圖（netVisual_chord_cell）展示
3.3 自動(dòng)保存所有推斷網(wǎng)絡(luò)的模塊以進(jìn)行快速探索
可以使用‘for … loop’自動(dòng)保存所有推斷網(wǎng)絡(luò)快速探索使用。netVisual，netVisual支持svg、png和pdf格式的輸出。
# 所有顯著的信號(hào)通路
pathways.show.all <- cellchat@netP$pathways
# 檢查細(xì)胞排序，選擇合適的受配體
levels(cellchat@idents)
vertex.receiver = seq(1,4)
for (i in 1:length(pathways.show.all)) {
# Visualize communication network associated with both signaling pathway and individual L-R pairs
netVisual(cellchat, signaling = pathways.show.all[i], vertex.receiver = vertex.receiver, layout = "hierarchy")
# Compute and visualize the contribution of each ligand-receptor pair to the overall signaling pathway
gg <- netAnalysis_contribution(cellchat, signaling = pathways.show.all[i])
ggsave(filename=paste0(pathways.show.all[i], "_L-R_contribution.pdf"), plot=gg, width = 3, height = 2, units = 'in', dpi = 300)
}
3.4 可視化由多個(gè)配體受體或信號(hào)通路調(diào)節(jié)的細(xì)胞通信
氣泡圖
可以使用netVisual_bubble顯示從某些細(xì)胞組到其他細(xì)胞組的所有重要相互作用（L-R對）。
# 顯示從某些細(xì)胞組到其他細(xì)胞組的所有顯著的相互作用（L-R 對）
netVisual_bubble(cellchat, sources.use = 4, targets.use = c(5:11), remove.isolate = FALSE)
#去掉sources.use = 4, targets.use = c(5:11)展示的是所有組的相互通訊
# 顯示從某細(xì)胞組到其他細(xì)胞組的某個(gè)通路的相互作用（L-R 對）
netVisual_bubble(cellchat, sources.use = 4, targets.use = c(5:11), signaling = c("CCL","CXCL"), remove.isolate = FALSE)
和弦圖
顯示從某些細(xì)胞組到其他細(xì)胞組的所有相互作用（L-R對或信號(hào)通路）。兩個(gè)特殊情況：一個(gè)顯示從一個(gè)細(xì)胞組發(fā)送的所有交互，另一個(gè)顯示一個(gè)細(xì)胞組接收的所有交互;顯示用戶輸入的交互或用戶定義的某些信號(hào)通路
#顯示從某些細(xì)胞組到其他細(xì)胞組的所有顯著的相互作用（L-R 對）
netVisual_chord_gene(cellchat, sources.use = 4, targets.use = c(5:11), lab.cex = 0.5,legend.pos.y = 30)
#同氣泡圖一樣，和弦圖也可以通過調(diào)整sources.use 、targets.use及signaling展示不同的通路，如果基因名稱重疊，可以通過降低small.gap值來調(diào)整參數(shù)。
3.5 使用小提琴/點(diǎn)圖繪制信號(hào)基因表達(dá)分布
可以利用Seurat 包裝的函數(shù)plotGeneExpression繪制與L-R對或信號(hào)通路相關(guān)的信號(hào)基因的基因表達(dá)分布圖。
plotGeneExpression(cellchat, signaling = "CXCL")
默認(rèn)情況下，可以通過plotGeneExpression只顯示與推斷的重要通信相關(guān)的信號(hào)基因的表達(dá),或者，用戶可以使用extractEnrichedLR提取與推斷的L-R對或信號(hào)通路相關(guān)的信號(hào)基因，然后使用Seurat包繪制基因表達(dá)圖。
plotGeneExpression(cellchat, signaling = "CXCL", enriched.only = FALSE)
4. 細(xì)胞通信網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)分析
為了便于對復(fù)雜的細(xì)胞間通信網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行解釋，CellChat 通過從圖形理論、模式識(shí)別和多重學(xué)習(xí)中抽象的方法對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行量化。
- 它可以使用網(wǎng)絡(luò)分析的集中度措施確定給定信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中的主要信號(hào)源和目標(biāo)以及調(diào)節(jié)者和影響者
- 它可以通過利用模式識(shí)別方法預(yù)測特定細(xì)胞類型的關(guān)鍵傳入和傳出信號(hào)，以及不同細(xì)胞類型之間的協(xié)調(diào)響應(yīng)。
- 它可以通過定義相似度測量方法和從功能和拓?fù)浣嵌冗M(jìn)行多重學(xué)習(xí)來分組信號(hào)通路。
- 它可以通過對多個(gè)網(wǎng)絡(luò)的聯(lián)合多重學(xué)習(xí)來描繪保存上下文特定的信號(hào)通路。
4.1 識(shí)別細(xì)胞組的信號(hào)角色（例如，占主導(dǎo)地位的發(fā)送器、接收器）以及主要貢獻(xiàn)信號(hào)
CellChat 允許通過計(jì)算每個(gè)細(xì)胞組的多個(gè)網(wǎng)絡(luò)中心測量，隨時(shí)識(shí)別細(xì)胞間通信網(wǎng)絡(luò)中占主導(dǎo)地位的發(fā)送者、接收者、調(diào)解者和影響者。具體來說，我們在加權(quán)導(dǎo)向網(wǎng)絡(luò)中采用了措施，包括度外、度內(nèi)、介于兩者之間流動(dòng)和信息集中度，分別識(shí)別細(xì)胞間通信的主要發(fā)送者、接收者、調(diào)解者和影響者。在以權(quán)重為計(jì)算通信概率的加權(quán)定向網(wǎng)絡(luò)中，將外向度計(jì)算為來自細(xì)胞組的傳出信號(hào)的通信概率之和，并計(jì)算為傳入信號(hào)對單元組通信概率的總和的度內(nèi)，可用于分別識(shí)別信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的主要單元件發(fā)送器和接收器。有關(guān)信息中心之間流動(dòng)的定義，請查看參考文獻(xiàn)1及參考文獻(xiàn)2。
計(jì)算和可視化網(wǎng)絡(luò)中心分?jǐn)?shù)
cellchat <- netAnalysis_computeCentrality(cellchat, slot.name = "netP") # “netP”:推斷出的信號(hào)通路的細(xì)胞間通信網(wǎng)絡(luò)
#使用熱圖可視化計(jì)算的中心性得分，以便及早識(shí)別細(xì)胞群的主要信號(hào)作用
netAnalysis_signalingRole_network(cellchat, signaling = pathways.show, width = 8, height = 2.5, font.size = 10)
在 2D 空間中可視化占主導(dǎo)地位的發(fā)送器（源）和接收器（目標(biāo)）
使用散點(diǎn)圖在 2D 空間中可視化占主導(dǎo)地位的發(fā)射器（源）和接收器（目標(biāo)）。
x軸和y軸分別為與每個(gè)單元組相關(guān)的總傳出或傳入通信概率。點(diǎn)的大小與每個(gè)單元組關(guān)聯(lián)的推斷鏈接(包括傳出鏈接和傳入鏈接)的數(shù)量成正比。點(diǎn)的顏色表示不同的細(xì)胞群。如果定義了“組”，點(diǎn)形狀表示單元格組的不同類別。
# 聚合細(xì)胞-細(xì)胞通信網(wǎng)絡(luò)中所有信號(hào)通路的信號(hào)作用分析
gg1 <- netAnalysis_signalingRole_scatter(cellchat)
# 感興趣的細(xì)胞-細(xì)胞通信網(wǎng)絡(luò)的信號(hào)作用分析
gg2 <- netAnalysis_signalingRole_scatter(cellchat, signaling = c("CXCL", "CCL"))
gg1 + gg2
識(shí)別對某些細(xì)胞組的傳出或傳入信號(hào)貢獻(xiàn)最大的信號(hào)
#識(shí)別所有信號(hào)對某些細(xì)胞組的傳出或傳入的貢獻(xiàn)
ht1 <- netAnalysis_signalingRole_heatmap(cellchat, pattern = "outgoing")
ht2 <- netAnalysis_signalingRole_heatmap(cellchat, pattern = "incoming")
ht1 + ht2
# #識(shí)別所有信號(hào)對某些細(xì)胞組的傳出或傳入的貢獻(xiàn)
ht <- netAnalysis_signalingRole_heatmap(cellchat, signaling = c("CXCL", "CCL"))
4.2 確定全局通信模式，探索多個(gè)細(xì)胞類型和信號(hào)通路如何協(xié)調(diào)在一起
除了探索單個(gè)通路的詳細(xì)通信外，一個(gè)重要問題是多個(gè)細(xì)胞組和信號(hào)通路如何協(xié)調(diào)功能。CellChat 采用模式識(shí)別方法識(shí)別全局通信模式。
隨著模式數(shù)量的增加，可能會(huì)有多余的模式，因此很難解釋通信模式。我們選擇了五種模式作為默認(rèn)模式。一般來說，它具有生物學(xué)意義，模式數(shù)量要大于2。此外，我們還提供了一個(gè)函數(shù)selectK來推斷模式的數(shù)量，該數(shù)基于 NMF R 包中已實(shí)施的兩個(gè)指標(biāo)Cophenetic和Silhouette。這兩個(gè)指標(biāo)都根據(jù)共識(shí)矩陣的分層聚類來衡量特定數(shù)量模式的穩(wěn)定性。對于一系列模式，適當(dāng)?shù)哪Ｊ綌?shù)量是Cophenetic 和 Silhouette值開始突然下降的模式。
識(shí)別和可視化分泌細(xì)胞的傳出通信模式
傳出模式揭示了發(fā)送者細(xì)胞（即作為信號(hào)源的細(xì)胞）如何相互協(xié)調(diào)，以及它們?nèi)绾闻c某些信號(hào)通路協(xié)調(diào)以驅(qū)動(dòng)通信。
為了直觀地顯示潛在模式與細(xì)胞群和配體受體對或信號(hào)通路的關(guān)聯(lián)，我們使用了河流（沖積）圖。我們首先將每行 W 和 H 的每列標(biāo)準(zhǔn)化為 [0，1]，然后在 W 和 H 中設(shè)置為零，如果它們小于 0.5。這種閾值允許發(fā)現(xiàn)與每個(gè)推斷模式相關(guān)的最豐富的細(xì)胞組和信號(hào)通路，即每個(gè)細(xì)胞組或信號(hào)通路僅與一個(gè)推斷模式相關(guān)聯(lián)。這些閾值矩陣 W 和 H 用作創(chuàng)建沖積圖的輸入。
為了將細(xì)胞群與其豐富的信號(hào)通路直接聯(lián)系起來，如果 W 和 H 中的元素少于 1/R（R 是潛在模式數(shù)），則我們將它們中的元素設(shè)置為零。通過使用不太嚴(yán)格的閾值，可以獲得與每個(gè)細(xì)胞組相關(guān)的更豐富的信號(hào)通路。我們使用每個(gè)細(xì)胞組對通過乘以 W 乘以 H 計(jì)算的每個(gè)信號(hào)通路的貢獻(xiàn)分?jǐn)?shù)，構(gòu)建了一個(gè)點(diǎn)圖，其中點(diǎn)大小與貢獻(xiàn)分?jǐn)?shù)成正比，以顯示細(xì)胞組與其豐富信號(hào)通路之間的關(guān)聯(lián)。用戶還可以降低參數(shù)cutoff，以顯示每個(gè)細(xì)胞組關(guān)聯(lián)的更豐富的信號(hào)通路。
#加載需要的包
library(NMF)
library(ggalluvial)
運(yùn)行selectK推斷模式的數(shù)量
#我們根據(jù)在NMF R包中實(shí)現(xiàn)的兩個(gè)指標(biāo)推斷出模式的數(shù)量，這兩個(gè)指標(biāo)包括Cophenetic和Silhouette。這兩個(gè)度量標(biāo)準(zhǔn)都是基于共識(shí)矩陣的層次聚類來衡量特定數(shù)量的模式的穩(wěn)定性。對于一個(gè)模式數(shù)量范圍，一個(gè)合適的模式數(shù)量是Cophenetic和Silhouette值開始突然下降的那個(gè)。
selectK(cellchat, pattern = "outgoing")
當(dāng)傳出模式數(shù)為 3 時(shí)，Cophenetic 和Silhouette值都開始突然下降。
nPatterns = 3
cellchat <- identifyCommunicationPatterns(cellchat, pattern = "outgoing", k = nPatterns)
河流圖
netAnalysis_river(cellchat, pattern = "outgoing")
點(diǎn)圖
netAnalysis_dot(cellchat, pattern = "outgoing")
識(shí)別和可視化目標(biāo)細(xì)胞的傳入通信模式
傳入模式顯示目標(biāo)細(xì)胞（即信號(hào)接收器中的細(xì)胞）如何相互協(xié)調(diào)，以及它們?nèi)绾闻c某些信號(hào)通路協(xié)調(diào)以響應(yīng)傳入的信號(hào)。
selectK(cellchat, pattern = "incoming")
當(dāng)傳入模式的數(shù)量為 4 時(shí)，Cophenetic 值開始下降。
nPatterns = 4
cellchat <- identifyCommunicationPatterns(cellchat, pattern = "incoming", k = nPatterns)
河流圖
netAnalysis_river(cellchat, pattern = "incoming")
點(diǎn)圖
netAnalysis_dot(cellchat, pattern = "incoming")
4.3 信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的多重和分類學(xué)習(xí)分析
CellChat 能夠量化所有重要信號(hào)通路之間的相似性，然后根據(jù)其CellChat 網(wǎng)絡(luò)的相似性對其進(jìn)行分組。分組可以基于功能或結(jié)構(gòu)相似性進(jìn)行。
功能相似性：功能相似度高表示主要發(fā)送器和接收器相似，可解釋為兩個(gè)信號(hào)通路或兩個(gè)配體受體對具有相似的作用。功能相似性分析要求兩個(gè)數(shù)據(jù)集之間的細(xì)胞群組成相同。
結(jié)構(gòu)相似性：結(jié)構(gòu)相似性用于比較其信號(hào)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，而不考慮發(fā)送器和接收器的相似性。
根據(jù)信號(hào)組的功能相似性識(shí)別信號(hào)組
cellchat <- computeNetSimilarity(cellchat, type = "functional")
cellchat <- netEmbedding(cellchat, type = "functional")
#Error in runUMAP(Similarity, min_dist = min_dist, n_neighbors = n_neighbors, :
Cannot find UMAP, please install through pip (e.g. pip install umap-learn or reticulate::py_install(packages = 'umap-learn')).
#解決方案：
library(reticulate)
py_available()
reticulate::py_install(packages = 'umap-learn')
#之后再運(yùn)行，如若還是報(bào)錯(cuò)，重啟R
cellchat <- netEmbedding(cellchat, type = "functional")
cellchat <- netClustering(cellchat, type = "functional")
netVisual_embedding(cellchat, type = "functional", label.size = 3.5)
# netVisual_embeddingZoomIn(cellchat, type = "functional", nCol = 2)
基于結(jié)構(gòu)相似性識(shí)別信號(hào)組
cellchat <- computeNetSimilarity(cellchat, type = "structural")
cellchat <- netEmbedding(cellchat, type = "structural")
cellchat <- netClustering(cellchat, type = "structural")
netVisual_embedding(cellchat, type = "structural", label.size = 3.5)
netVisual_embeddingZoomIn(cellchat, type = "structural", nCol = 2)
5. 保存CellChat對象
以便后續(xù)使用
saveRDS(cellchat, file = "cellchat_humanSkin_LS.rds")
參考來源
CellChat三部曲1：使用CellChat對單個(gè)數(shù)據(jù)集進(jìn)行細(xì)胞間通訊分析
運(yùn)行cellchat分析時(shí)遇到的一些問題
致謝
I thank Dr.Jianming Zeng(University of Macau), and all the members of his bioinformatics team, biotrainee, for generously sharing their experience and codes.
THE END
