今天要記錄一個(gè)很實(shí)用的實(shí)驗(yàn)技巧：如題，怎么利用低濃度的質(zhì)粒包好慢病毒嗎？
慢病毒已經(jīng)成為目前生命科學(xué)領(lǐng)域一個(gè)很常用的進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控的實(shí)驗(yàn)方法了。目前也很多公司商業(yè)化包裝能達(dá)到很好的效果，但是公司流程化需要的試驗(yàn)周期比較長(zhǎng)，有的時(shí)候著急用，或者只是想做個(gè)前期摸索實(shí)驗(yàn)，這時(shí)候再交由公司做不免浪費(fèi)錢也耗費(fèi)時(shí)間，所以自己最好還是也要會(huì)包裝慢病毒。
一些常規(guī)的慢病毒相關(guān)的知識(shí)我就不重復(fù)了。參考：慢病毒包裝實(shí)驗(yàn)so easy！詳細(xì)步驟及滴度測(cè)定看過來！
詳細(xì)如上述鏈接，以及我們可能也聽到過這么一句話：進(jìn)行轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒濃度最好是≥500ng/uL，不然轉(zhuǎn)染效果一般都不好。
一般來說，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也確實(shí)如此。
**【實(shí)驗(yàn)記錄如下】**
第一次實(shí)驗(yàn)：
預(yù)計(jì)用三質(zhì)粒系統(tǒng)進(jìn)行慢病毒包裝，分別是pCDH-CAG-3HA-EGFP-T2A-PURO, psPAX2和pMD2.G。設(shè)計(jì)使用的質(zhì)粒比例pCDH-CAG-EGFP-PURO : psPAX2 : pMD2.G = 4:3:1。
一個(gè)10mm2培養(yǎng)皿的HEK293T細(xì)胞（~70%-90%匯合度），使用總共25微克質(zhì)粒，即12.5ug pCDH-CAG-EGFP-PURO, 9.375ug psPAX2和3.125ug pMD2.G。轉(zhuǎn)染試劑準(zhǔn)備
使用的轉(zhuǎn)染試劑為ThermoFisher的lipo3000平替——聚合美m(xù)f138-02（也是lipo3000，組分和使用完全一樣）。
Reagent A: 625 uL Opti-MEM + 18.75 uL （準(zhǔn)備4份）
Reagent B: 625 uL Opti-MEM + plasmids + 25 uLP3000
· 質(zhì)粒使用如下：
psPAX2: 496 ng/uL, 取18.9 uL/rnx；
pMD2.G: 526.98 ng/uL，取5.93 uL/rnx；
plasmid-1: 147.9 ng/uL，取84.5 uL；
plasmid-2: 189.68 ng/uL, 取65.9 uL；
plasmid-3: 74.4 ng/uL, 取168 uL；
plasmid-4: 235.9 ng/uL, 取53 uL。
混勻后，A，B各自室溫孵育5分鐘，之后將Reagent-A加入到Reagent-B中，輕輕吹打混勻，室溫孵育20分鐘。實(shí)驗(yàn)結(jié)果
轉(zhuǎn)染后48小時(shí)和72小時(shí)分別在熒光顯微鏡下觀看綠色熒光情況，結(jié)果plasmid4的熒光最亮，大約是85%以上的細(xì)胞帶有GFP+，其次是plasmid-1，大約60%細(xì)胞呈GFP+， plasmid-2和plasmid-3的熒光非常弱，大約只有20%左右的細(xì)胞帶有GFP+
我不死心，收取了各10mL上清（48-72小時(shí)之間）并利用PEG8000-NaCl溶液過夜沉淀后4000xg,4℃離心20分鐘的方法進(jìn)行了慢病毒的濃縮，并使用濃縮后的慢病毒進(jìn)行HEK293T細(xì)胞的感染（病毒滴度粗滴定），結(jié)果還是和轉(zhuǎn)染時(shí)一樣，這個(gè)陽(yáng)性率得到的病毒顯然是無法高效滿足實(shí)驗(yàn)需求的。
原因分析&第二次實(shí)驗(yàn)
我在想真的是質(zhì)粒的原因嗎？想到重新轉(zhuǎn)化和質(zhì)粒大提真的很煩。。。偷懶使人進(jìn)步，
我首先想是不是因?yàn)閜lasmid的插入片段長(zhǎng)度不一樣導(dǎo)致在實(shí)際轉(zhuǎn)染使用的質(zhì)粒量上需要調(diào)整，而不能都一致用12.5ug， 結(jié)果由于plasmid-4和plasmid-3的長(zhǎng)度是一樣的但是結(jié)果不一樣，我推翻了這個(gè)猜想。
后來我重新思考lipo3000質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的原理：lipo3000轉(zhuǎn)染試劑其本質(zhì)是一種陽(yáng)離子脂質(zhì)體。它的作用原理是借鑒了liposome脂質(zhì)體包裹質(zhì)粒DNA，通過生物膜融合原理將質(zhì)粒DNA遞送進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞這一生物學(xué)現(xiàn)象，利用帶正電的陽(yáng)離子脂質(zhì)體來結(jié)合帶負(fù)電的質(zhì)粒DNA，形成DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物，從而吸附到帶負(fù)電的細(xì)胞膜表面，再經(jīng)內(nèi)吞作用導(dǎo)入細(xì)胞。（要是我說錯(cuò)了請(qǐng)指正不要杠我）
于是我突然靈光一現(xiàn)想到，會(huì)不會(huì)是由于質(zhì)粒濃度不一致導(dǎo)致的使用體積的不一致引起的慢病毒包裝失敗呢？（即是否需要根據(jù)reagent-B的總體積來調(diào)整reagent-A的用量？）
于是我開始了我第二次實(shí)驗(yàn)：
Reagent-A：不變，但是準(zhǔn)備5份 Reagent-B：不變 A和B的混合根據(jù)B的總體積進(jìn)行調(diào)整，取與Reagent-B差不多的體積進(jìn)行混合孵育，再轉(zhuǎn)染。
48小時(shí)后在熒光顯微鏡下觀察熒光，結(jié)果表明，所有質(zhì)粒組的HEK293T細(xì)胞都有90%+以上呈現(xiàn)GFP+。
細(xì)胞無明顯死亡和掉落。
成功了?。?！
當(dāng)然如果想進(jìn)行濃縮，按照分子克隆的操作即可：
這個(gè)是本人進(jìn)行過的成功操作，大概得率如下：
74.4 ng/uL的質(zhì)粒1毫升，最后濃縮為704.6 ng/uL，58微升；
147.9 ng/uL的質(zhì)粒1.2毫升，最后濃縮905 ng/uL，168微升。
更新：實(shí)操可行的慢病毒濃縮方法（沒有超速離心怎么濃縮慢病毒？）
慢病毒感染踩坑——病毒濃度過高會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，但是又想偷懶的話就多做幾個(gè)梯度的病毒進(jìn)行感染，保證一次就能拿到感染成果的細(xì)胞?。?！
另外！??！
慢病毒實(shí)驗(yàn)請(qǐng)?jiān)诙?jí)生物安全柜操作?。。?！如果只能在超凈臺(tái)操作，切勿開通風(fēng)?。。?！珍愛自己的生命?。。。。?br>
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