RNA結(jié)合蛋白（RNA-binding proteins，RBPs）對(duì)轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控至關(guān)重要，包括RNA修飾（如N6?甲基腺苷酸化（m6A））、剪接、多聚腺苷酸化、定位、翻譯和降解。RBPs的失調(diào)與多種人類疾病密切相關(guān)，包括癌癥、神經(jīng)退行性疾病、代謝紊亂和組織分化異常。盡管傳統(tǒng)上對(duì)RBPs的研究主要集中于其與RNA、蛋白質(zhì)和翻譯后修飾的相互作用，但越來(lái)越多的證據(jù)表明，小生物分子（small biomolecules，SBMs），例如糖類、核苷酸、代謝物（如S?腺苷甲硫氨酸（SAM）和NAD(P)H）以及藥物，可以直接與RBPs結(jié)合，并調(diào)節(jié)其結(jié)構(gòu)、定位和RNA結(jié)合活性。這些依賴于情景和濃度的相互作用將RBP調(diào)控與細(xì)胞代謝聯(lián)系起來(lái)，是當(dāng)前研究的重點(diǎn)。在本綜述中，我們將探討SBM結(jié)合RBPs的不斷擴(kuò)展的研究進(jìn)展，以及這些RBPs在凝聚體形成、RNA定位、加工和翻譯中的功能。我們將重點(diǎn)闡述這些相互作用的分子機(jī)制及其與人類疾病的功能相關(guān)性。此外，我們還將探討SBM?RBP相互作用鑒定方面的最新進(jìn)展，以及推動(dòng)這一快速發(fā)展領(lǐng)域取得突破性發(fā)現(xiàn)的創(chuàng)新方法?？傊?，這些見(jiàn)解凸顯了SBMs在調(diào)節(jié)RBPs和開(kāi)發(fā)新型治療策略方面的潛力。
在人類基因組編碼的約20,000種蛋白質(zhì)中，RNA結(jié)合蛋白（RBPs）代表了一個(gè)非常豐富且功能多樣的類別，包含1,500多個(gè)成員，占人類基因組中所有蛋白質(zhì)編碼基因的7.5%以上。RBPs通常在人類細(xì)胞中高表達(dá)，這凸顯了它們的功能重要性。RBPs通過(guò)直接與RNA接觸，協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)錄后和共轉(zhuǎn)錄基因調(diào)控的幾乎所有方面，例如RNA加帽、剪接、運(yùn)輸、穩(wěn)定性和翻譯。RBP表達(dá)、活性或定位的擾動(dòng)與癌癥、神經(jīng)退行性疾病、代謝紊亂和組織分化異常的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。
盡管翻譯后修飾和蛋白質(zhì)?蛋白質(zhì)相互作用等機(jī)制已被證實(shí)是RBP活性的調(diào)節(jié)因子，但近期研究揭示了由小生物分子（SBMs）介導(dǎo)的另一層調(diào)控機(jī)制。這些小生物分子包括糖類、核苷酸、代謝物和合成化合物，它們可以直接與RBP結(jié)合并調(diào)節(jié)其活性。SBM的結(jié)合可以改變RNA的結(jié)合親和力，影響亞細(xì)胞定位，并驅(qū)動(dòng)RBPs的構(gòu)象轉(zhuǎn)變，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)其功能的快速、可逆控制。這種調(diào)控模式不僅限于已充分表征的ATP依賴性RNA解旋酶，還包括與腺苷甲硫氨酸（SAM）、GTP、α?酮戊二酸和其他細(xì)胞代謝物結(jié)合的蛋白質(zhì)——這表明RBP活性受細(xì)胞代謝狀態(tài)的調(diào)控。
對(duì)SBM?RBP直接相互作用的分析不僅提高了我們對(duì)代謝與RNA調(diào)控整合的理解，也為靶向疾病相關(guān)RBPs的治療提供了新的契機(jī)。本文綜述了SBM直接結(jié)合調(diào)控人類經(jīng)典RBPs的新興原理。我們根據(jù)RBPs的SBM結(jié)合特性對(duì)其進(jìn)行分類，重點(diǎn)闡述了這些相互作用的分子和功能后果，并探討了與SBM結(jié)合的RBPs相關(guān)的疾病，包括RBP抑制劑在疾病治療中的作用。最后，我們討論了目前研究SBM?RBP相互作用的方法及其面臨的挑戰(zhàn)。
小分子生物分子?RNA結(jié)合蛋白相互作用概述
在已鑒定的1,542種RNA結(jié)合蛋白（RBPs）中，有226種具有與小分子（不包括金屬離子）結(jié)合的基因本體術(shù)語(yǔ)（補(bǔ)充圖1a），這表明小分子結(jié)合對(duì)于RBPs來(lái)說(shuō)并不罕見(jiàn)。通過(guò)整合基因本體術(shù)語(yǔ)和文獻(xiàn)綜述，我們系統(tǒng)地將結(jié)合小分子的RBPs（不包括模板依賴性聚合酶）分為七個(gè)主要類別：ATP結(jié)合、GTP結(jié)合、糖結(jié)合、二氫尿苷合成酶（DUS）、非模板依賴性聚合酶、甲基轉(zhuǎn)移酶和脫甲基酶（雙加氧酶）（補(bǔ)充圖1b）。RBPs的內(nèi)源性小分子配體包括ATP、GTP和SAM（補(bǔ)充圖1c），它們分別被解旋酶、翻譯因子和甲基轉(zhuǎn)移酶利用。這種對(duì)核苷衍生物的偏好進(jìn)一步延伸到結(jié)合還原型NAD(P)H的DUS和NAT10（也稱為RNA胞苷乙酰轉(zhuǎn)移酶），后者與其他小分子（例如乙酰輔酶A）相互作用。除了經(jīng)典的酶-底物和酶-輔因子相互作用之外，結(jié)合小分子的RBPs還表現(xiàn)出多種功能。在本節(jié)中，我們將討論這些RBPs的各種功能類別以及它們相關(guān)的SBMs如何調(diào)節(jié)其活性。
RNA解旋酶
人類已報(bào)道超過(guò)60種經(jīng)典的RNA解旋酶，它們均屬于SF1或SF2超家族。這些超家族共享一個(gè)保守的核心結(jié)構(gòu)域，即兩個(gè)RecA樣結(jié)構(gòu)域RecA1和RecA2，它們協(xié)同結(jié)合核苷三磷酸和RNA，但通常缺乏RNA特異性。SF2超家族包含DEAH-box和DEAD-box解旋酶，它們共同構(gòu)成了人類RNA解旋酶的大多數(shù)?！癉EAD/DEAH”的命名源于直接與ATP接觸的氨基酸序列；然而，對(duì)這些家族的分類不僅依賴于這些基序，還依賴于整個(gè)解旋酶結(jié)構(gòu)域的更廣泛序列比對(duì)。在功能上，DEAH-box和UPF1樣解旋酶與RNA的連續(xù)易位和“絞合”機(jī)制相關(guān)，通過(guò)鏈牽引改變遠(yuǎn)端RNA的結(jié)構(gòu)。然而，并非所有DEAH解旋酶都表現(xiàn)出持續(xù)運(yùn)動(dòng)。相比之下，DEAD box解旋酶主要參與短RNA雙鏈的解旋，而不發(fā)生易位。雖然許多RNA結(jié)合蛋白通過(guò)結(jié)合暴露的堿基來(lái)促進(jìn)RNA單鏈化，但只有典型的解旋酶利用核苷酸水解來(lái)驅(qū)動(dòng)RNA解旋。
ATP與RNA解旋酶的RecA結(jié)構(gòu)域結(jié)合，結(jié)合位點(diǎn)遠(yuǎn)離RNA結(jié)合位點(diǎn)（補(bǔ)充圖1d）。RecA結(jié)構(gòu)域的功能類似于一對(duì)鉗子，當(dāng)ATP結(jié)合時(shí)，它們會(huì)夾住RNA，從而將RNA鏈拉開(kāi)；當(dāng)ATP水解時(shí)，它們會(huì)重新打開(kāi)。一個(gè)典型的RNA解旋酶循環(huán)，例如DDX3X的循環(huán)，涉及幾個(gè)構(gòu)象變化：?jiǎn)误w無(wú)配體狀態(tài)對(duì)雙鏈RNA（dsRNA）具有親和力，二聚體與dsRNA結(jié)合形成“預(yù)解旋復(fù)合物”；解旋酶與ATP結(jié)合后，誘導(dǎo)預(yù)解旋復(fù)合物發(fā)生構(gòu)象變化，導(dǎo)致每個(gè)DDX3X單體拉開(kāi)一條RNA鏈，最終導(dǎo)致dsRNA解旋并形成解旋后復(fù)合物。ATP水解隨后引發(fā)一系列構(gòu)象變化，導(dǎo)致單鏈RNA（ssRNA）的釋放，形成解旋酶釋放后狀態(tài)（圖1a）。結(jié)構(gòu)研究表明，第一種狀態(tài)和最后一種狀態(tài)具有相似的構(gòu)象，區(qū)別僅在于是否存在結(jié)合的ADP。
盡管ATP在解旋酶功能中起著至關(guān)重要的作用，但ATP的可用性不太可能是解旋酶調(diào)控的限制因素。據(jù)報(bào)道，RNA解旋酶對(duì)ATP的親和力通常在中微摩爾范圍內(nèi)（約100μM或更低），而細(xì)胞內(nèi)ATP濃度通常在低毫摩爾范圍內(nèi)。鑒于ATP水平在所有生命領(lǐng)域都保持較高水平，且細(xì)胞內(nèi)ATP濃度通常高于ADP水平，因此只有ATP親和力極低的解旋酶才可能受到ATP可用性的調(diào)控，但目前尚未有此類實(shí)例報(bào)道。然而，未來(lái)對(duì)不同細(xì)胞區(qū)室中ATP/ADP/Mg2+比值的研究或許能夠揭示解旋酶調(diào)控的新機(jī)制。
RNA甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基酶
人類所有RNA甲基轉(zhuǎn)移酶均以SAM為輔因子，而所有已知的RNA去甲基化酶均依賴于α?酮戊二酸。SAM由甲硫氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶催化ATP和甲硫氨酸合成，是一種核苷衍生的SBM，其結(jié)構(gòu)與腺苷相連（補(bǔ)充圖1c）。
甲基轉(zhuǎn)移酶至少可以分為五個(gè)家族，其中Rossmann折疊家族（也稱為七β折疊家族）是最大的家族，包含至少49個(gè)人類基因，此外還有進(jìn)化上保守的SPOUT家族。主要的RNA甲基轉(zhuǎn)移酶屬于這兩個(gè)家族，包括NSUNs、tRNA甲基轉(zhuǎn)移酶（TRMTs）和甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白（METTLs）。SPOUT家族幾乎專門(mén)負(fù)責(zé)tRNA和rRNA的甲基化，而羅斯曼折疊甲基轉(zhuǎn)移酶則表現(xiàn)出更廣泛的底物特異性。本節(jié)討論的所有甲基轉(zhuǎn)移酶都屬于羅斯曼折疊家族，但TRMT10C除外，它屬于SPOUT家族。
相比之下，人類RNA去甲基化酶數(shù)量較少，且它們都屬于Fe(II)/2-酮戊二酸依賴性雙加氧酶超家族。從進(jìn)化角度來(lái)看，它們被分為ALKBH家族（包括FTO和ALKBH蛋白）和TET蛋白家族（補(bǔ)充圖1b）。ALKBH酶可以去除多種RNA、DNA和蛋白質(zhì)的甲基化修飾，其中ALKBH2是唯一尚未被報(bào)道作用于RNA的酶。盡管結(jié)構(gòu)相似，但ALKBH家族成員由于RNA識(shí)別元件、催化裂隙大小和非同源結(jié)構(gòu)域的差異，表現(xiàn)出不同的底物偏好。
高通量測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步揭示了轉(zhuǎn)錄組中RNA甲基化修飾的廣泛存在。其中，N6?甲基腺苷（m6A）最為豐富。至少有七種甲基轉(zhuǎn)移酶參與m6A的沉積，包括METTL3?METTL14、METTL4、ZCCHC、METTL5、METTL16和TFB1M。這些酶靶向不同的RNA種類：METTL3和METTL14協(xié)同作用將m6A沉積在mRNA上，ZCCHC4和METTL5修飾rRNA，TFB1M修飾線粒體rRNA，METTL4靶向microRNA，而METTL16甲基化U6小核RNA（snRNA）和MAT2A mRNA。m6A的去甲基化主要由FTO和ALKBH5完成（圖1b–f）。
除了m6A之外，至少還鑒定了六種RNA甲基化類型。N5?甲基胞嘧啶（m5C）由NSUN酶和DNMT2（也稱為T(mén)RDMT1）沉積，并由TET1和TET2去除。m1A主要存在于tRNA和rRNA中，由TRMTs和NML（也稱為RRP8）催化，并由ALKBH1、ALKBH3和FTO去除。TRMT61B、TRMT6?TRMT61A和TRMT10C將m1A添加到mRNA中，并由ALKBH3去除。m3C由METTL2A、METTL2B和METTL6添加到tRNA上，由METTL8添加到mRNA上。ALKBH1可以從mRNA中去除m3C。N7?甲基鳥(niǎo)苷（m7G）存在于多種RNA中，包括mRNA（由RNMT甲基化）、tRNA（由METTL1甲基化）和18S rRNA（由WBSCR22甲基化）。CMTR1和CMTR2在mRNA的第一個(gè)和第二個(gè)轉(zhuǎn)錄核苷酸上添加2′?O?甲基化修飾，而纖維蛋白、TRMT13和HENMT1分別在mRNA、tRNA和Piwi互作RNA上添加2′?O?甲基化修飾。最后，N6,2′-O?二甲基腺苷（m6Am）由PCIF1催化。并通過(guò)FTO從mRNA中去除。其他tRNA甲基化由多種TRMT酶催化（圖1b–f）。
Rossmann折疊SAM結(jié)合位點(diǎn)和解旋酶ATP結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出顯著的相似性，兩者都由β折疊兩側(cè)的α螺旋構(gòu)成三層結(jié)構(gòu)（補(bǔ)充圖1d），確實(shí)一些SAM依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶也能結(jié)合并水解ATP。RNA解旋酶的許多特征，包括具有核苷衍生的配體以及RNA、SBM配體和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)之間的三向相互作用，都反映了SBM調(diào)控的RNA結(jié)合蛋白的共同特征。在METTL3-METTL14異二聚體和DDX3X同二聚體，RNA結(jié)合在Rossmann折疊界面形成的裂隙內(nèi)，RecA結(jié)構(gòu)域和配體結(jié)合分別調(diào)節(jié)該裂隙的形狀。相比之下，雙加氧酶采用獨(dú)特的果凍卷結(jié)構(gòu)，其中包含一個(gè)可容納α?酮戊二酸和離子配體的口袋。盡管存在這些結(jié)構(gòu)差異，但雙加氧酶中配體和底物結(jié)合仍然相互關(guān)聯(lián)：α?酮戊二酸增強(qiáng)AlkB對(duì)底物的親和力并穩(wěn)定其構(gòu)象，而分子動(dòng)力學(xué)分析表明，RNA與FTO的結(jié)合會(huì)將α?酮戊二酸重新定位到活性位點(diǎn)，從而促進(jìn)催化。甲基轉(zhuǎn)移酶和雙加氧酶與RNA和配體結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)顯示，環(huán)狀結(jié)構(gòu)能夠夾住RNA，引導(dǎo)其沿著球狀結(jié)構(gòu)域外表面靠近配體的帶正電荷的溝槽移動(dòng)，接觸范圍延伸至多個(gè)堿基（補(bǔ)充圖1d）。
與細(xì)胞中含量始終豐富的ATP不同，SAM的水平（平均~10 μM）會(huì)根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)發(fā)生顯著波動(dòng)（10倍至100倍）。SAM的合成本身也受到MAT2A mRNA甲基化的調(diào)控，MAT2A mRNA編碼一種關(guān)鍵的SAM合成酶，這是維持SAM穩(wěn)態(tài)的反饋回路的一部分。甲基轉(zhuǎn)移酶-SAM結(jié)合與RNA識(shí)別之間的相互作用在不同酶之間存在差異。例如，METTL3-METTL14異二聚體（補(bǔ)充圖1d）首先與SAM結(jié)合，這會(huì)誘導(dǎo)構(gòu)象變化，從而使其能夠結(jié)合RNA（圖2a）。相比之下，METTL16首先與U6 snRNA結(jié)合，然后再與SAM結(jié)合，但它與其他靶標(biāo)的相互作用方式各不相同。值得注意的是，METTL16具有較高的RNA結(jié)合親和力（納摩爾級(jí)），但對(duì)SAM的親和力卻低得多（126 μM），這使得其活性對(duì)細(xì)胞內(nèi)SAM水平更加敏感。類似地，α-酮戊二酸結(jié)合的RBPs也會(huì)對(duì)配體和抑制性代謝物濃度的生理波動(dòng)做出反應(yīng)。盡管細(xì)胞內(nèi)α-酮戊二酸的水平通常在數(shù)百微摩爾范圍內(nèi)，并且FTO與其結(jié)合的解離常數(shù)（Kd）值為4 μM——這表明其通常不敏感——但在某些情況下，2-羥基戊二酸水平升高可以有效地與α-酮戊二酸競(jìng)爭(zhēng)并抑制FTO的活性。在體外，其他代謝物，例如富馬酸、琥珀酸和檸檬酸，可以拮抗α-酮戊二酸依賴性脫甲基酶，包括FTO和ALKBH5，盡管有效的抑制通常需要高濃度。
其他RNA修飾因子
除了甲基化之外，RNA還可以進(jìn)行多種其他修飾。例如，二氫尿苷（DHU）由DUSs和DUS樣酶（DUSLs）引入tRNA，從而促進(jìn)tRNA的結(jié)構(gòu)適應(yīng)。DUS1L以NAD(P)H為輔因子，將尿苷還原為二氫尿苷。同樣，MTO1以FAD為配體，催化線粒體tRNA中的5??；撬峒谆?/b>尿苷修飾（τm5U）（圖1c）。乙酰輔酶A作為NAT10依賴的N4?乙酰胞苷（ac4C）修飾的輔因子，修飾rRNA、tRNA和mRNA（圖1b?d）。糖殘基（Gly）分別由喹諾??tRNA半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和tRNA?喹諾?α?甘露糖基轉(zhuǎn)移酶添加到tRNA上，它們分別利用核苷酸糖尿苷二磷酸（UDP）?半乳糖和GDP?甘露糖（圖1c）。有趣的是，2′,3′?環(huán)核苷酸3′?磷酸二酯酶是一種在神經(jīng)系統(tǒng)中含量豐富的膜相關(guān)酶，它利用NADP+催化2′,3′?環(huán)核苷酸轉(zhuǎn)化為未修飾的核苷酸。這種不尋常的酶活性的生理意義尚不清楚。最后，無(wú)模板RNA聚合酶如poly(A)聚合酶、poly(U)聚合酶、CCA添加酶（圖1c）和2′?5′?寡腺苷酸合成酶，作為其酶促功能的一部分，與核苷酸結(jié)合。
結(jié)合GTP的RBPs
GTP被RBPs利用，包括翻譯因子關(guān)聯(lián)（TRAFAC）家族的GTP酶成員，例如延伸因子Tu（EF?Tu）、EF?G和Obg家族。EF?Tu的GTP結(jié)合域是一種Rossmann折疊結(jié)構(gòu)，存在于17種人類蛋白質(zhì)中。該結(jié)構(gòu)域促進(jìn)氨酰tRNA遞送至核糖體，并在正確識(shí)別密碼子?反密碼子后水解GTP。在TRAFAC類中，Obg超家族包含多種GTP結(jié)合蛋白（GTPBPs）和發(fā)育調(diào)控GTP結(jié)合蛋白（DRGs），它們?cè)诜g和核糖體生物合成中發(fā)揮著不同的作用（圖2a）。值得注意的是，GTPBP10和GTPBP5是Obg家族蛋白的兩個(gè)人類同源物，它們參與線粒體核糖體生物合成，而一些Obg蛋白，如OLA1，可以增強(qiáng)富含D/E的mRNA的翻譯效率。
其他結(jié)合小分子的RBPs
除了解旋酶之外，還報(bào)道了其他一些能結(jié)合ATP的RBPs。異質(zhì)核糖核蛋白U（HNRNPU）中含有AAA+ ATPase結(jié)構(gòu)域，據(jù)報(bào)道該蛋白能結(jié)合并水解ATP。ATP結(jié)合促進(jìn)HNRNPU寡聚化（圖2b），這可能促進(jìn)染色質(zhì)?新生RNA復(fù)合物的結(jié)構(gòu)變化。線粒體蛋白酶LONP1也與ATP結(jié)合，從而抑制其與RNA的相互作用（圖2a）。
越來(lái)越多的RBPs被發(fā)現(xiàn)可以與糖或糖衍生物結(jié)合（圖2）。例如，HuR（也稱為ELAVL1）可以與UDP-葡萄糖結(jié)合，并與RNA結(jié)合存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。果糖-6-磷酸（F6P）與真核翻譯起始因子2B亞基-α（eIF2Bα）結(jié)合可以增強(qiáng)其二聚化，從而激活eIF2B復(fù)合物。研究表明，葡萄糖也可以與NSUN2、DDX21和DDX50結(jié)合。葡萄糖結(jié)合可以增強(qiáng)NSUN2的SAM結(jié)合親和力、寡聚化和酶活性。相比之下，葡萄糖在DDX21和DDX50中與ATP結(jié)合存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，導(dǎo)致二聚體解離。雖然超出本文綜述的范圍，但RBPs也可以發(fā)生糖基化。例如，有報(bào)道稱RBP核磷蛋白會(huì)發(fā)生糖基化并重新定位到細(xì)胞表面。
其他代謝調(diào)節(jié)劑包括油酸，它直接與MSI1的RNA識(shí)別基序（RRM）相互作用，變構(gòu)抑制其RNA結(jié)合活性；以及L?脯氨酸，它通過(guò)與NONO的第二個(gè)RRM結(jié)構(gòu)域結(jié)合來(lái)穩(wěn)定NONO二聚化（圖2）。
小分子代謝物（SBMs）與RNA結(jié)合蛋白（RBPs）之間的相互作用比之前認(rèn)為的更為普遍，這引發(fā)了一個(gè)問(wèn)題：究竟存在多少SBM-RBP相互作用？許多細(xì)胞代謝物的細(xì)胞內(nèi)濃度很高，包括乳酸（在各種組織中濃度為1.5–40 mM）、ATP（1–10?mM）和神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸（在星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元中濃度為10–100 mM）。在這些濃度下，即使代謝物的親和力較弱，解離常數(shù)在微摩爾級(jí)別（對(duì)應(yīng)于結(jié)合自由能約為-4.5 kcal mol?1）也可能具有重要的功能意義。SBMs相對(duì)于其蛋白質(zhì)伴侶的豐度表明，許多其他RBPs可能持續(xù)與小分子相互作用，從而動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)RNA代謝以響應(yīng)代謝波動(dòng)。
小分子結(jié)合RBPs的功能
ATP、GTP、SAM和乙酰輔酶A等小分子可以通過(guò)改變RBPs的構(gòu)象、RNA結(jié)合親和力、酶活性和亞細(xì)胞定位來(lái)影響這些蛋白。因此，這些小分子有助于通過(guò)液-液相分離形成生物分子凝聚體，并影響RNA的定位、加工和翻譯。
凝聚體（Condensate）的形成和功能
細(xì)胞含有多種富含蛋白質(zhì)和RNA的凝聚體，包括核仁（nucleoli）、核斑點(diǎn)（nuclear speckles）、應(yīng)激顆粒（stress granules）和加工小體（processing bodies）。這些細(xì)胞區(qū)室是通過(guò)液-液相分離形成的，這種現(xiàn)象發(fā)生在分子由于移動(dòng)性、高濃度和優(yōu)先相互作用等因素而分離成不同相時(shí)——而RNA和RBPs就具備這些條件。應(yīng)激顆粒由Ras GTP酶激活蛋白結(jié)合蛋白1（G3BP1）及其相關(guān)蛋白標(biāo)記，并富含poly(A) RNA，在翻譯抑制條件下形成。盡管應(yīng)激顆粒的確切功能尚未完全闡明，但它們的形成受保守的分子原理調(diào)控。新出現(xiàn)的證據(jù)表明，RNA修飾有助于應(yīng)激顆粒的組裝。例如，m6A及其寫(xiě)入酶METTL3可能介導(dǎo)RNA在應(yīng)激顆粒中的富集（圖3）。此外，m6A甲基化的mRNA與YTH家族m6A閱讀蛋白結(jié)合，這些復(fù)合物會(huì)分配到各種內(nèi)源性無(wú)膜區(qū)室中，包括應(yīng)激顆粒和核斑。另外，NAT10依賴的ac4C沉積已被證明可以增強(qiáng)RNA向應(yīng)激顆粒的分配。有趣的是，核仁蛋白58在NAT10依賴的條件下易位到應(yīng)激顆粒中。這種依賴性方式突顯了核仁和應(yīng)激顆粒之間潛在的相互作用（圖3）。值得注意的是，生理水平的游離ATP可通過(guò)ATP與蛋白質(zhì)外部特定氨基酸的接觸在體外溶解RBP凝聚體，這表明ATP在體內(nèi)將細(xì)胞能量狀態(tài)與凝聚體形成聯(lián)系起來(lái)方面發(fā)揮作用。
RNA定位
SBMs通過(guò)與RBPs相互作用調(diào)控RNA定位，從而通過(guò)甲基化和解旋酶活性促進(jìn)mRNA從細(xì)胞核輸出。SAM促進(jìn)細(xì)胞核內(nèi)mRNA的甲基化，包括m7G、m6A、m5C和m1A，這些甲基化均有助于mRNA的核輸出（圖3）。mRNA 5′端共轉(zhuǎn)錄添加的m7G帽結(jié)構(gòu)特征明確，它通過(guò)連接帽結(jié)合復(fù)合物和轉(zhuǎn)錄?輸出（TREX）復(fù)合物來(lái)促進(jìn)mRNA的輸出。DDX39B（UAP56）是TREX中的一種ATP依賴性解旋酶，它能解開(kāi)RNA使其與ALYREF（也稱為T(mén)HOC4）結(jié)合，從而促進(jìn)RNA的輸出。在核孔的胞質(zhì)端，DDX19通過(guò)其SBM上的六磷酸肌醇（IP6）與mRNA輸出因子GLE1結(jié)合，從而促進(jìn)解旋酶活性，驅(qū)動(dòng)RNA輸出到胞質(zhì)（圖3）。然而，IP6在RBP和/或RNA調(diào)控中的功能目前尚不明確。
多種解旋酶以ATP結(jié)合和解旋酶活性依賴的方式調(diào)節(jié)RNA在應(yīng)激顆粒中的定位（圖3）。eIF4A在翻譯起始期間解開(kāi)mRNA 5′非翻譯區(qū)（5′ UTR）中的結(jié)構(gòu)，從而抑制應(yīng)激顆粒的組裝。類似地，DHX36可解開(kāi)5′ UTR RNA，抑制DHX36可降低翻譯并增加應(yīng)激顆粒的定位。相反，DDX3可促進(jìn)應(yīng)激顆粒的形成，這可能是通過(guò)與其他RBPs相互作用實(shí)現(xiàn)的，而靶向其ATP結(jié)合位點(diǎn)或RNA結(jié)合位點(diǎn)的抑制劑可以抑制這種作用。
mRNA加工
mRNA的加帽、加尾、剪接和降解均由SBM結(jié)合的RBPs介導(dǎo)（圖3）。Poly(A)聚合酶利用ATP添加聚腺苷酸尾，而RNA甲基轉(zhuǎn)移酶（RNMT）以SAM為輔因子催化5′端加帽。ATP對(duì)于剪接體的組裝和催化至關(guān)重要，驅(qū)動(dòng)關(guān)鍵的剪接轉(zhuǎn)換。例如，結(jié)合ATP的PRP28（一種DEAD-box RNA解旋酶）重塑5′剪接位點(diǎn)的RNA，以確保剪接的準(zhǔn)確性。類似地，DHX38水解ATP，使3′剪接位點(diǎn)能夠正確定位，從而實(shí)現(xiàn)外顯子?外顯子連接。SAM結(jié)合的METTL16催化3′剪接位點(diǎn)的m6A修飾，從而阻斷剪接因子U2AF35對(duì)該位點(diǎn)的識(shí)別，抑制前體mRNA的剪接。相反，SAM結(jié)合的METTL3在5′UTR中沉積m6A，進(jìn)而募集YTH蛋白和剪接因子來(lái)調(diào)控前體mRNA的加工。類似地，由SAM結(jié)合的NSUN2在RNA中沉積的m5C能夠募集富含絲氨酸/精氨酸的剪接因子2進(jìn)行前體mRNA的剪接。其他RNA修飾，包括m7G和m1A，也參與前體mRNA的剪接。此外，葡萄糖與DDX21的結(jié)合促進(jìn)其組裝成剪接因子復(fù)合物，從而影響組織分化過(guò)程中的前體mRNA剪接。
SBMs還通過(guò)調(diào)節(jié)RBPs來(lái)調(diào)控RNA穩(wěn)定性。RNA解旋酶在RNA降解中起著關(guān)鍵作用；例如，ATP依賴性解旋酶MTR4（也稱為DExH9）招募RNA外切體復(fù)合物進(jìn)行解旋酶驅(qū)動(dòng)的RNA降解，而UPF1利用ATP水解來(lái)重塑RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物并促進(jìn)無(wú)義介導(dǎo)的mRNA降解（nonsense-mediated mRNA decay，NMD）（圖 3）。除了解旋酶之外，RBP HuR通過(guò)與三四脯氨酸相互作用來(lái)阻止mRNA降解，從而穩(wěn)定mRNA。然而，UDP-葡萄糖與HuR的結(jié)合會(huì)抑制HuR與SNAI1 mRNA的結(jié)合，從而觸發(fā)其降解。此外，SAM依賴性m6A、m1A和內(nèi)部m7G修飾會(huì)促進(jìn)NMD，而帽式m7G和m5C修飾則增強(qiáng)mRNA穩(wěn)定性。最后，葡萄糖與DDX50的結(jié)合會(huì)增強(qiáng)其與雙鏈RNA結(jié)合蛋白Staufen同源物1（STAU1）的相互作用，從而抑制UPF1–STAU1 NMD復(fù)合物的形成。反過(guò)來(lái)，DDX50的缺失會(huì)導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞分化過(guò)程中RNA的不穩(wěn)定。
RNA翻譯
SBMs通過(guò)與RBPs結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)翻譯，從而影響核糖體募集、翻譯起始和延伸（圖3）。ATP依賴性DEAD-box解旋酶，例如eIF4A、DHX36和DDX3，能夠重塑RNA結(jié)構(gòu)，從而在起始階段增強(qiáng)核糖體與mRNA的結(jié)合。EF?Tu將氨酰tRNA遞送至核糖體A位點(diǎn)，而EF?G則驅(qū)動(dòng)核糖體沿mRNA的易位，二者均由GTP水解驅(qū)動(dòng)。SAM結(jié)合甲基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)RNA修飾，例如mRNA中的加帽和內(nèi)部m7G修飾，編碼序列中的m6A修飾以及tRNA中的m1A修飾，所有這些修飾均能提高翻譯效率。此外，葡萄糖與NSUN2結(jié)合，從而促進(jìn)其與翻譯復(fù)合物的結(jié)合，進(jìn)而提高翻譯效率（圖3）。
疾病中的小生物分子?RBP相互作用
鑒于SBM?RBP相互作用在RNA加工中起著至關(guān)重要的作用，它們的失調(diào)與多種疾病有關(guān)，包括癌癥、神經(jīng)退行性疾病、代謝性疾病和組織分化異常。
癌癥
RNA解旋酶在多種癌癥中經(jīng)常發(fā)生突變，導(dǎo)致mRNA加工失調(diào)和細(xì)胞異常生長(zhǎng)（圖4a）。ATP結(jié)合在這一調(diào)控過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。例如，DDX3X既具有抑癌功能，也具有致癌功能。對(duì)兒童髓母細(xì)胞瘤中DDX3X突變的晶體學(xué)表征發(fā)現(xiàn)，其N端存在一個(gè)不同于經(jīng)典ATP結(jié)合域的新型ATP結(jié)合環(huán)，該環(huán)介導(dǎo)ATP水解。這一發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了ATP結(jié)合完整性對(duì)于腫瘤發(fā)生過(guò)程中解旋酶活性的必要性。同樣，編碼RNA解旋酶的DDX41的種系突變與家族性急性髓系白??。ˋML）有關(guān)，而AML中的體細(xì)胞突變通常發(fā)生在ATP結(jié)合域，這可能導(dǎo)致功能減弱效應(yīng)。
其他SBMs通過(guò)與RNA甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基酶結(jié)合，在癌癥中發(fā)揮關(guān)鍵作用（圖4a）。METTL3介導(dǎo)的m6A甲基化具有依賴于情景的抑癌和致癌功能。METTL3的缺失會(huì)降低m6A水平并促進(jìn)肝細(xì)胞癌和胃癌。相反，METTL3活性升高會(huì)促進(jìn)癌基因轉(zhuǎn)錄本（如EGFR、STAT5和MYC）的穩(wěn)定性或翻譯，從而增強(qiáng)腫瘤發(fā)生。同樣，F(xiàn)TO也表現(xiàn)出依賴于特定環(huán)境的抑癌和致癌功能。FTO通過(guò)與α?酮戊二酸結(jié)合，使包括KRAS、MYC和STAT3在內(nèi)的癌基因轉(zhuǎn)錄本去甲基化，從而調(diào)節(jié)其在十多種癌癥中的穩(wěn)定性和翻譯。m5C甲基轉(zhuǎn)移酶NSUN2可作為癌癥預(yù)后標(biāo)志物。m5C的高甲基化可穩(wěn)定癌基因轉(zhuǎn)錄本，例如膀胱癌中的HDGF mRNA和肝細(xì)胞癌中的H19長(zhǎng)鏈非編碼RNA。NSUN2驅(qū)動(dòng)的m5C甲基化激活肝細(xì)胞癌和食管癌中的致癌WNT、PI3K–AKT和ERK–MAPK通路。此外，葡萄糖結(jié)合促進(jìn)NSUN2寡聚化，從而增強(qiáng)mRNA甲基化和腫瘤發(fā)生，并驅(qū)動(dòng)免疫治療耐藥性。
在癌癥中，SBMs可直接與其他RBPs相互作用并調(diào)控它們（圖4a）。已知能穩(wěn)定富含AU的mRNA的RBP HuR與癌癥進(jìn)展相關(guān)。UDP?葡萄糖與HuR的結(jié)合會(huì)抑制其與上皮?間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)SNAI1 mRNA的結(jié)合，導(dǎo)致SNAI1 mRNA降解并減少肺癌轉(zhuǎn)移。然而，EGFR介導(dǎo)的UDP?葡萄糖6-脫氫酶Tyr473位點(diǎn)的磷酸化激活了該酶將UDP?葡萄糖轉(zhuǎn)化為UDP?葡萄糖醛酸的活性，從而逆轉(zhuǎn)了這種抑制作用，這與轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)和肺癌預(yù)后不良相關(guān)。總的來(lái)說(shuō)，這些發(fā)現(xiàn)突顯了多效性作用SBM?RBP在癌癥中的相互作用。
神經(jīng)退行性疾病
大腦需要對(duì)RNA加工進(jìn)行精確的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，以調(diào)節(jié)基因的時(shí)空表達(dá)，這一過(guò)程高度依賴于RBPs。RBPs失調(diào)長(zhǎng)期以來(lái)被認(rèn)為與神經(jīng)退行性疾病有關(guān)，而近期的全基因組關(guān)聯(lián)研究進(jìn)一步將RBPs變異與精神疾病聯(lián)系起來(lái)。
TDP43是hnRNP家族的成員，在RNA加工中起著至關(guān)重要的作用，包括轉(zhuǎn)錄、剪接、運(yùn)輸和穩(wěn)定性。TDP43的病理性聚集是肌萎縮側(cè)索硬化癥和額顳葉癡呆等神經(jīng)退行性疾病的標(biāo)志性特征。TDP43的功能性寡聚化可對(duì)抗病理性聚集，而ATP與N端結(jié)構(gòu)域的結(jié)合可增強(qiáng)功能性寡聚化并減少聚集（圖4）。然而，與ALS相關(guān)的D169G突變會(huì)破壞ATP結(jié)合，從而促進(jìn)聚集和疾病發(fā)生。鑒于較高的ATP水平可減少蛋白質(zhì)聚集，ATP耗竭會(huì)促進(jìn)TDP43聚集，且ATP水平下降在神經(jīng)退行性疾病中很常見(jiàn)，因此，調(diào)節(jié)ATP水平或開(kāi)發(fā)能增強(qiáng)ATP與TDP43相互作用的小分子模擬物可能有助于治療ALS，對(duì)神經(jīng)退行性疾病具有治療意義。
eIF2B是一種參與翻譯起始過(guò)程的必需GTP結(jié)合蛋白，在罕見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病——白質(zhì)消失癥中發(fā)生突變。除了GTP之外，eIF2B還能結(jié)合糖磷酸酯，例如F6P，這些糖磷酸酯可以變構(gòu)增強(qiáng)翻譯效率（圖4b）。與白質(zhì)消失癥相關(guān)的eIF2Bα(N208Y) 突變體無(wú)法結(jié)合糖磷酸酯；相比之下，F(xiàn)6P可以恢復(fù)eIF2Bα(V183F)突變體的活性，該突變體雖然破壞了二聚體形成，但仍保留了糖磷酸酯結(jié)合能力。這些發(fā)現(xiàn)表明，糖磷酸酯結(jié)合能夠促進(jìn)eIF2B復(fù)合物的形成和翻譯（圖4b）。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了SBM-eIF2B相互作用對(duì)于mRNA翻譯的重要性及其與白質(zhì)消失癥的相關(guān)性。
代謝紊亂
全基因組關(guān)聯(lián)研究表明，多種RBPs與代謝性疾病相關(guān)。FTO是最早被發(fā)現(xiàn)與2型糖尿病?險(xiǎn)增加相關(guān)的基因之一。FTO后來(lái)被鑒定為一種m6A去甲基酶，在包括肝臟、下丘腦、骨骼肌和脂肪組織在內(nèi)的多種組織中表達(dá)。近期研究發(fā)現(xiàn)，NAD(P)H是與FTO具有高親和力結(jié)合的代謝產(chǎn)物。值得注意的是，NAD(P)H特異性地與FTO結(jié)合，并增強(qiáng)其去甲基酶活性（對(duì)去甲基酶ALKBH5的影響甚微）。高脂飲食引起的NADPH水平升高導(dǎo)致了FTO依賴性的脂肪生成（圖4c）。
除了代謝物外，非必需氨基酸（在2型糖尿病患者中通常升高）也可能在?糖升高中發(fā)揮致病作用。由RBPs NONO?SFPQ?PSPC1復(fù)合物與NEAT1長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）和靶mRNA結(jié)合形成的paraspeckles通過(guò)多種機(jī)制調(diào)控基因表達(dá)。結(jié)構(gòu)研究表明，L?脯氨酸通過(guò)結(jié)合NONO的RRM2結(jié)構(gòu)域來(lái)穩(wěn)定NONO二聚體，這可能干擾RNA相互作用（圖4c）。最近一項(xiàng)在糖尿病小鼠模型中的研究表明，肝細(xì)胞中L?脯氨酸水平升高會(huì)降低NONO與NEAT1的結(jié)合，從而導(dǎo)致NEAT1降解和paraspeckles形成受損。因此，Ppargc1a和Foxo1等mRNA被釋放到細(xì)胞質(zhì)中，導(dǎo)致蛋白質(zhì)表達(dá)增加，從而增強(qiáng)糖異生和高?糖（圖4c）。值得注意的是，在這些小鼠中恢復(fù)paraspeckles的形成可以改善高?糖，這表明L?脯氨酸調(diào)控可能是一種潛在的糖尿病治療策略。
組織分化異常
研究表明，葡萄糖水平升高是驅(qū)動(dòng)組織特異性分化的RBPs的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。例如，葡萄糖與DDX21（一種對(duì)表皮分化至關(guān)重要的RNA解旋酶）結(jié)合并取代ATP，導(dǎo)致DDX21解聚并從核仁重新定位到核質(zhì)中的剪接相關(guān)復(fù)合物，從而促進(jìn)分化相關(guān)剪接。類似地，葡萄糖與ATP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合DDX50（一種相關(guān)的解旋酶），改變其多聚化狀態(tài)并促進(jìn)其與STAU1的相互作用，STAU1可在轉(zhuǎn)錄后水平穩(wěn)定促分化轉(zhuǎn)錄物（圖4d）。另一個(gè)有趣的ATP-葡萄糖開(kāi)關(guān)調(diào)節(jié)DDX21和DDX50，并影響組織分化。在增殖細(xì)胞中，ATP水平較高，這些DDX蛋白與ATP結(jié)合并參與RNA解旋。然而，隨著分化的進(jìn)行，ATP水平下降，葡萄糖水平升高，DDX21和DDX50轉(zhuǎn)而與葡萄糖結(jié)合，從而將其功能轉(zhuǎn)向RNA剪接或穩(wěn)定。此外，葡萄糖通過(guò)促進(jìn)NSUN2（一種對(duì)表皮分化至關(guān)重要的甲基轉(zhuǎn)移酶）與SAM的結(jié)合來(lái)增強(qiáng)其活性，從而促進(jìn)mRNA翻譯。
脂肪酸介導(dǎo)的RBPs調(diào)控對(duì)于神經(jīng)和上皮譜系干細(xì)胞的功能至關(guān)重要。MSI1結(jié)合并穩(wěn)定硬脂酰輔酶A去飽和酶（SCD或SCD1）的mRNA，該mRNA編碼一種將硬脂酸轉(zhuǎn)化為油酸的酶，并與細(xì)胞增殖相關(guān)。反過(guò)來(lái)，油酸直接結(jié)合MSI1的RNA結(jié)合域（RRM），并變構(gòu)抑制其RNA結(jié)合活性，這表明存在一個(gè)反饋回路，其中MSI1作為脂肪酸傳感器，將脂肪酸代謝與干細(xì)胞增殖和分化聯(lián)系起來(lái)。值得注意的是，MSI1失調(diào)導(dǎo)致的異常細(xì)胞增殖與多種癌癥相關(guān)。
RNA結(jié)合蛋白的小分子生物抑制劑
RBP抑制劑是治療由RBP功能失調(diào)引起的疾?。òò┌Y和神經(jīng)退行性疾病）的潛在有效藥物。迄今為止，已開(kāi)發(fā)出70多種特性明確的小分子，可直接靶向26種經(jīng)典的RBPs。這些抑制劑包括RNA甲基化讀取蛋白抑制劑，例如IGF2BP1和YTHDFs；寫(xiě)入蛋白抑制劑，例如METTL3、METTL16、NSUN2、NSUN3和NSUN6；以及擦除蛋白抑制劑，例如FTO和ALKBH5。此外，還開(kāi)發(fā)了針對(duì)RNA解旋酶的小分子，包括G3BP1、eIF4E、eIF4A、DDX3、DDX5以及DHX9；并針對(duì)一系列與疾病相關(guān)的RBPs，包括HuR、LIN28、TDP43、SF3B1、HNRNPA18、RBM39、TARBP2、PUM1、XPO1、MSI2和ZC3H14。
這些抑制劑能夠調(diào)節(jié)RNA代謝的多個(gè)方面。例如，靶向FTO、eIF4E和SF3B1的小分子已在急性髓系白??。ˋML）等癌癥中展現(xiàn)出治療潛力。它們分別通過(guò)干擾mRNA去甲基化、帽依賴性翻譯和前體mRNA剪接發(fā)揮作用。在神經(jīng)退行性疾病中，抑制TDP43的化合物正被研究用于減輕肌萎縮側(cè)索硬化癥和額顳葉癡呆相關(guān)的RNA毒性。最近，一種將靶向蛋白質(zhì)的SBM與募集E3泛素連接酶的小分子連接的蛋白水解靶向嵌合體（PROTAC）系統(tǒng)已被用作RBP抑制劑，以誘導(dǎo)RBP降解。例如，靶向METTL3-METTL14復(fù)合物的PROTAC WD6305顯示出作為AML潛在治療藥物的潛力。越來(lái)越多的RBP靶向化合物正在推進(jìn)臨床開(kāi)發(fā)，其中一些已經(jīng)獲得FDA批準(zhǔn)用于治療，這凸顯了靶向RBPs的SBMs在人類疾病中日益增長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化潛力。
研究小生物分子?RNA結(jié)合蛋白相互作用的方法
SBM?RBP相互作用的動(dòng)態(tài)特性要求采用整合生物化學(xué)、生物物理和細(xì)胞學(xué)技術(shù)的綜合方法來(lái)對(duì)其進(jìn)行表征。本節(jié)將討論用于研究SBM?RBP相互作用的方法。
基于質(zhì)譜的方法
基于質(zhì)譜的多組學(xué)方法，包括蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)，已被廣泛用于研究SBM-蛋白質(zhì)相互作用，包括SBM-RBP相互作用。傳統(tǒng)的化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)用于鑒定SBM結(jié)合蛋白，通常包括SBM下拉實(shí)驗(yàn)，然后進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）分析。常見(jiàn)的下拉技術(shù)包括柱富集、基于生物素探針的親和純化和基于點(diǎn)擊化學(xué)的捕獲。例如，葡聚糖柱已成功用于富集葡萄糖結(jié)合蛋白，揭示RBP可以與葡萄糖相互作用。使用固定化激酶抑制劑鑒定激酶的激酶組親和beads的成功應(yīng)用表明，靶向RBP的SBM也可以以類似的方式使用。基于生物素的探針已被廣泛用于捕獲SBM結(jié)合蛋白，包括ATP、AMP、溶血磷脂酸和葡萄糖。這些基于親和力的下拉方法始終表明，在富集的蛋白質(zhì)中，RBP占有很高的比例。具體而言，對(duì)脫硫生物素修飾肽的篩選可以通過(guò)化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定SBM結(jié)合位點(diǎn)并發(fā)現(xiàn)基序。基于點(diǎn)擊化學(xué)的下拉技術(shù)也已應(yīng)用于鑒定與葡萄糖、UDP-葡萄糖和其他SBM相互作用的蛋白質(zhì)，進(jìn)一步證明RBP參與這些SBM相互作用。此外，還開(kāi)發(fā)了新的標(biāo)記平臺(tái)，用于基于化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)的SBM結(jié)合蛋白靶點(diǎn)鑒定，例如全功能化片段探針和電親和標(biāo)記，擴(kuò)展了未來(lái)研究SBM-RBP相互作用的可能性。
利用生物素連接酶（例如BirA、BASU、APEX或Turbo）進(jìn)行鄰近標(biāo)記已被廣泛應(yīng)用于研究蛋白質(zhì)?蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)?RNA和蛋白質(zhì)?DNA相互作用。在此基礎(chǔ)上，一種名為生物素靶向嵌合體（biotin targeting chimera，BioTAC）的方法被開(kāi)發(fā)出來(lái)，用于精確繪制小分子相互作用組圖譜。BioTAC使用由目標(biāo)化合物與選擇性FKBP12(F36V) 募集劑orthoAP1867連接而成的雙功能分子。這種設(shè)計(jì)使得可與配體結(jié)合的鄰近標(biāo)記酶(miniTurbo?FKBP12F36V)能夠募集到化合物結(jié)合的復(fù)合物上，從而促進(jìn)其生物素化和后續(xù)的親和純化。這種基于鄰近標(biāo)記的方法能夠捕獲活細(xì)胞中瞬時(shí)結(jié)合SBM的蛋白質(zhì)和復(fù)合物。
熱蛋白質(zhì)組分析（Thermal proteome profiling，TPP），也稱為細(xì)胞熱位移分析結(jié)合質(zhì)譜（CETSA?MS），已被用于研究SBM結(jié)合蛋白，例如ATP結(jié)合蛋白和蛋白抑制劑。有趣的是，RBP始終位列富集蛋白之列。TPP的高通量改進(jìn)方法，例如蛋白質(zhì)組整體溶解度改變（PISA）和藥物親和力響應(yīng)靶標(biāo)穩(wěn)定性（DARTS），進(jìn)一步拓展了我們研究SBM?蛋白質(zhì)相互作用的能力，并在多項(xiàng)研究中一致地將RBPs鑒定為關(guān)鍵組分。
有限蛋白水解（LiP）與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，于2017年以LiP小分子圖譜（LiP-SMap）的形式報(bào)道，已被證明對(duì)代謝物?RBP相互作用網(wǎng)絡(luò)以及SBM結(jié)合位點(diǎn)的鑒定具有重要價(jià)值。其他基于LiP的技術(shù)，如肽中心局部穩(wěn)定性分析（PELSA），在目標(biāo)蛋白質(zhì)鑒定方面具有極高的靈敏度，同時(shí)還能提供結(jié)合區(qū)域信息。
其他化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)利用整體氨基酸反應(yīng)性來(lái)分析SBM的結(jié)合蛋白，同時(shí)精確定位結(jié)合位點(diǎn)。例如，NHS-炔基點(diǎn)擊化學(xué)和碘乙酰胺-脫硫生物素（IA-DTB）等策略利用鏈霉親和素富集來(lái)評(píng)估SBM處理下賴氨酸和半胱氨酸的可及性。半胱氨酸蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，包括半胱氨酸反應(yīng)性磷酸標(biāo)簽（CPTs）結(jié)合固定化金屬親和色譜（IMAC），最初是為鑒定金屬離子結(jié)合蛋白而設(shè)計(jì)的，有望用于SBM結(jié)合研究。類似地，同位素串聯(lián)正交蛋白水解活性分析（isoTOP-ABPP）已被應(yīng)用于反應(yīng)性半胱氨酸和賴氨酸，從而能夠定量測(cè)定結(jié)合位點(diǎn)?；蛘?，靶標(biāo)響應(yīng)可及性分析（TRAP）（使用同位素標(biāo)記的甲醛進(jìn)行賴氨酸甲基化）和蛋白質(zhì)氧化速率穩(wěn)定性（SPROX）測(cè)定（監(jiān)測(cè)甲硫氨酸氧化動(dòng)力學(xué)）這兩種方法均不需要富集，可簡(jiǎn)化SBM-蛋白質(zhì)相互作用的分析。
除了蛋白質(zhì)組學(xué)之外，代謝組學(xué)方法也被用于鑒定SBM?蛋白質(zhì)相互作用。例如，一種基于親和蛋白純化和質(zhì)譜的檢測(cè)方法已被開(kāi)發(fā)用于大規(guī)模鑒定蛋白質(zhì)?疏水性小分子代謝物相互作用。質(zhì)譜與平衡透析相結(jié)合的系統(tǒng)性變構(gòu)發(fā)現(xiàn)（MIDAS）方法通過(guò)評(píng)估代謝物在透析膜上的分布，實(shí)現(xiàn)了對(duì)代謝物?蛋白質(zhì)相互作用的系統(tǒng)性檢測(cè)。盡管這兩種方法尚未應(yīng)用于SBM?RBP相互作用的研究，但它們?yōu)槲磥?lái)的研究提供了有前景的方向。
利用蛋白質(zhì)?代謝物相互作用基于大小分離（PROMIS）對(duì)蛋白質(zhì)?代謝物相互作用進(jìn)行全局分析，該方法結(jié)合了基于大小的分級(jí)分離、代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)。然而，由于相互作用網(wǎng)絡(luò)基于共洗脫，因此需要正交驗(yàn)證方法來(lái)精確識(shí)別特定的蛋白質(zhì)?代謝物對(duì)。
體外試驗(yàn)
利用純化的重組RBPs可以對(duì)SBM?RBP相互作用進(jìn)行體外表征。微尺度熱泳（MST）、表面等離子體共振（SPR）、熒光偏振、等溫滴定量熱法（ITC）和電泳遷移率變動(dòng)分析（EMSA）等技術(shù)已成功應(yīng)用于定量結(jié)合親和力（Kd）和評(píng)估相互作用特異性。包括核磁共振、X射線晶體衍射和冷凍電鏡在內(nèi)的結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)，能夠提供高分辨率的SBM-RBP相互作用信息，為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和SBM的精確結(jié)合位點(diǎn)提供互補(bǔ)的視角。迄今為止，已解析出755個(gè)僅包含人類RBPs的PDB結(jié)構(gòu)，其中293個(gè)結(jié)構(gòu)包含SBM配體，這些結(jié)構(gòu)至少使用了上述方法之一進(jìn)行解析。
以RBP為中心的方法
傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)-RNA結(jié)合檢測(cè)技術(shù)，例如交聯(lián)免疫沉淀（crosslinking and immunoprecipitation，CLIP），已被用于研究SBM-RBP相互作用，從而深入了解SBM誘導(dǎo)的RBP與RNA結(jié)合的變化。HITS-CLIP、PAR-CLIP、iCLIP、eCLIP、irCLIP和easyCLIP等方法利用紫外（UV）介導(dǎo)的交聯(lián)將RBP共價(jià)連接到其RNA靶標(biāo)上，隨后進(jìn)行免疫沉淀、酶解和高通量測(cè)序。結(jié)合SBM處理，CLIP已被用于鑒定改變的RBP-RNA結(jié)合位點(diǎn)，揭示小分子如何影響RNA-蛋白質(zhì)相互作用。將CLIP與定量蛋白質(zhì)組學(xué)相結(jié)合，可以進(jìn)一步闡明SBM調(diào)控RNA上RBP組裝的分子機(jī)制。或者，可以通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄（使用生物素化的核苷酸或酶促標(biāo)記）將RNA標(biāo)記上生物素，從而選擇性地捕獲RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，以便通過(guò)質(zhì)譜或蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)行分析，無(wú)論是否使用SBM。基于鄰近性的質(zhì)譜技術(shù)，例如RNA-蛋白質(zhì)相互作用檢測(cè)（RaPID），也可用于研究SBMs如何影響RNA-蛋白質(zhì)相互作用。
計(jì)算方法
分子對(duì)接、分子動(dòng)力學(xué)模擬、機(jī)器學(xué)習(xí)和人工智能（AI）驅(qū)動(dòng)的預(yù)測(cè)等先進(jìn)計(jì)算方法極大地促進(jìn)了SBM?RBP相互作用的研究。分子對(duì)接可以預(yù)測(cè)SBM在已通過(guò)實(shí)驗(yàn)解析結(jié)構(gòu)和使用AlphaFold建模的RBP上的結(jié)合位點(diǎn)。該方法已被用于闡明HuR?UDP?葡萄糖相互作用的分子機(jī)制，并模擬葡萄糖與DDX21和DDX50的結(jié)合。分子動(dòng)力學(xué)模擬提供了關(guān)于SBM?RBP復(fù)合物的結(jié)合動(dòng)力學(xué)、構(gòu)象變化和穩(wěn)定性隨時(shí)間變化的深入見(jiàn)解。例如，分子動(dòng)力學(xué)分析已識(shí)別出hnRNPA1中的配體結(jié)合口袋，從而指導(dǎo)了配體篩選研究。此外，基于現(xiàn)有結(jié)構(gòu)和結(jié)合親和力數(shù)據(jù)訓(xùn)練的人工智能和深度學(xué)習(xí)模型能夠預(yù)測(cè)新的SBM?蛋白質(zhì)相互作用，并優(yōu)化SBM以提高其特異性。這些計(jì)算方法加速了調(diào)控RBP功能的SBM的發(fā)現(xiàn)和設(shè)計(jì)，從而促進(jìn)了治療藥物的開(kāi)發(fā)和基礎(chǔ)RNA生物學(xué)研究。
其他方法
基于熒光的檢測(cè)方法是可視化和分析SBM?蛋白質(zhì)相互作用的有力工具。例如，活細(xì)胞成像技術(shù)能夠研究SBM?RBP在天然細(xì)胞環(huán)境中的相互作用。雙光子熒光各向異性成像技術(shù)此前已被用于測(cè)量活細(xì)胞中藥物?靶點(diǎn)結(jié)合情況，也可應(yīng)用于研究SBM-RBP相互作用。將水溶性和細(xì)胞膜滲透性熒光團(tuán)（例如ORFluor染料）連接到SBMs上，有助于對(duì)這些相互作用進(jìn)行定量活細(xì)胞成像。此外，代謝物親和力響應(yīng)靶標(biāo)熒光猝滅（MARTFQ）檢測(cè)方法已被廣泛用于篩選SBM?RBP相互作用，并發(fā)現(xiàn)了新的相互作用。
技術(shù)挑戰(zhàn)
鑒定特定的SBM?RBP相互作用仍然是一項(xiàng)相當(dāng)大的挑戰(zhàn)。與底物明確的酶不同，RBPs識(shí)別多種多樣的RNA序列和結(jié)構(gòu)，這增加了對(duì)其研究的復(fù)雜性。許多SBMs表現(xiàn)出低親和力或瞬時(shí)相互作用，使得傳統(tǒng)的生化和結(jié)構(gòu)方法難以檢測(cè)它們。某些SBMs固有的不穩(wěn)定性進(jìn)一步增加了鑒定其結(jié)合蛋白的難度。RBPs功能和結(jié)合基序的重疊導(dǎo)致其冗余性，使得選擇性靶向變得復(fù)雜。在細(xì)胞中，與內(nèi)源性配體的競(jìng)爭(zhēng)以及翻譯后修飾會(huì)影響SBM的結(jié)合，從而引入額外的變異性。整合蛋白質(zhì)組學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)和計(jì)算建模等先進(jìn)技術(shù)，可以精確繪制SBM?RBP相互作用圖譜，從而緩解這些挑戰(zhàn)。
結(jié)論與展望
SBMs對(duì)RBPs的調(diào)控是一個(gè)新興領(lǐng)域，對(duì)轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控具有深遠(yuǎn)意義。靶向SBM?RBP相互作用為癌癥、神經(jīng)退行性疾病、RBP活性失調(diào)的代謝性疾病以及組織分化異常等疾病提供了有前景的治療途徑。然而，這一快速發(fā)展的領(lǐng)域值得進(jìn)一步探索，以發(fā)現(xiàn)更多機(jī)制和治療機(jī)會(huì)。
盡管一些小分子結(jié)合基序已被鑒定，但仍有許多基序未知，這限制了我們對(duì)小分子結(jié)合基序如何調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能的理解。蛋白質(zhì)ATP結(jié)合基序和GTP結(jié)合基序是研究最為深入的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域之一，其磷酸鹽結(jié)合環(huán)（P-loop）內(nèi)含有保守的GXXXXGK序列，該序列有助于核苷酸的識(shí)別和水解。然而，其他小分子的結(jié)合基序仍未得到充分研究。一種很有前景的方法是利用反應(yīng)性配體?脫硫生物素探針從消化的蛋白質(zhì)組中富集SBM結(jié)合肽序列，從而鑒定潛在的結(jié)合位點(diǎn)。此外，有限的蛋白質(zhì)組學(xué)分析和基于賴氨酸/半胱氨酸反應(yīng)性的蛋白質(zhì)組學(xué)方法能夠識(shí)別配體結(jié)合后發(fā)生的結(jié)構(gòu)變化，為定位新的結(jié)合基序提供了一種補(bǔ)充策略。這些方法與計(jì)算建模相結(jié)合，可能會(huì)擴(kuò)展我們對(duì)SBM結(jié)合特異性的認(rèn)識(shí)。
靶向RBPs是一種很有前景的疾病治療策略。然而，由于毒性和靶向特異性有限等問(wèn)題，開(kāi)發(fā)靶向RBP的療法面臨著巨大的挑戰(zhàn)。脫靶效應(yīng)會(huì)加劇毒性，而且由于許多RBPs對(duì)基本的細(xì)胞功能至關(guān)重要，抑制它們可能會(huì)導(dǎo)致廣泛的功能障礙或細(xì)胞死亡。為了應(yīng)對(duì)這些挑戰(zhàn)，一種可能的策略是尋找具有RBP結(jié)合潛力的現(xiàn)有化合物，從而加速治療藥物的研發(fā)并最大限度地降低毒性。特別是，重新利用已獲臨床批準(zhǔn)的激酶抑制劑（其中許多是ATP競(jìng)爭(zhēng)性分子）提供了一種極具吸引力且切實(shí)可行的方法。由于所有RNA解旋酶都具有ATP結(jié)合親和力，且解旋酶活性失調(diào)與多種疾病相關(guān)，因此值得探索這些ATP競(jìng)爭(zhēng)性激酶抑制劑是否也能與RBP結(jié)合并調(diào)節(jié)其活性。如果這些抑制劑被證實(shí)能有效靶向RBPs，它們就可以被迅速用于治療RBP相關(guān)疾病，從而繞過(guò)藥物發(fā)現(xiàn)的早期階段，并顯著縮短新療法進(jìn)入臨床所需的時(shí)間。
總之，RBPs與SBMs之間直接相互作用這一新興領(lǐng)域正在重塑我們對(duì)轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控和疾病發(fā)病機(jī)制的理解。傳統(tǒng)上，RBPs被視為被動(dòng)結(jié)合RNA或在結(jié)合后發(fā)生誘導(dǎo)契合的剛性支架，但越來(lái)越多的研究表明，RBPs是能夠進(jìn)行配體驅(qū)動(dòng)構(gòu)象循環(huán)的動(dòng)態(tài)分子機(jī)器。超過(guò)14%的已注釋人類RBPs已知與SBMs存在相互作用，揭示了從雙加氧酶的細(xì)微重排到解旋酶的大規(guī)模構(gòu)象變化等一系列響應(yīng)。RBPs與豐富的細(xì)胞代謝物結(jié)合所需的能量相對(duì)較低，這表明還有更多RBPs與SBMs相互作用。持續(xù)的研究有望揭示先前未知的基因調(diào)控層面。這些發(fā)現(xiàn)可能為靶向治療策略開(kāi)辟新的途徑，尤其是在RBPs功能失調(diào)驅(qū)動(dòng)的疾病中。
Miao, W., Porter, D.F., Lopez-Pajares, V.?et al.?Regulation of RNA-binding proteins by small biomolecules.?Nat Rev Mol Cell Biol?(2025). https://doi.org/10.1038/s41580-025-00914-4
