2021年9月6日，清華大學(xué)王建斌團(tuán)隊(duì)和中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院吳晨團(tuán)隊(duì)的研究人員在?Nature Communications?上發(fā)表關(guān)于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析揭示食管鱗狀細(xì)胞癌的腫瘤微環(huán)境的文章，研究人員采用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄測(cè)序技術(shù)對(duì)60例食管鱗狀細(xì)胞癌患者的腫瘤組織和4例正常組織進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序，揭示了食管鱗狀細(xì)胞癌腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制狀況，為深入了解食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病和進(jìn)展機(jī)制提供了基礎(chǔ)。
接下來(lái)小編帶大家一起走進(jìn)這篇文章深入了解作者的研究思路及主要結(jié)論。
【發(fā)表期刊】Nature Communications?
【發(fā)布時(shí)間】2021年9月6日
【影響因子】14.919
研究背景
食管癌是臨床常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，是全球第七大常見(jiàn)的癌癥。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)食管癌發(fā)病率和死亡率呈快速上升趨勢(shì)，而食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell carcinoma , ESCC）占我國(guó)食管癌總數(shù)的90%以上，ESCC 的5年生存率約為20-30%，這可能是由于早期診斷困難和缺乏有效治療引起的，因此剖析 ESCC 腫瘤微環(huán)境（Tumor microenvironment , TME）的細(xì)胞組成及變化，對(duì)于建立早期診斷和創(chuàng)造有效的治療至關(guān)重要。
在過(guò)去的幾十年中，已有許多關(guān)于 ESCC 轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究報(bào)道，但之前的研究是依賴于 cDNA 微陣列或 Bulk 測(cè)序，不能說(shuō)明在異質(zhì)性腫瘤組織中的細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種有效方法，已被證明能夠?qū)Ξ愘|(zhì)性腫瘤組織進(jìn)行分析，并破譯腫瘤細(xì)胞與其微環(huán)境之間的相互作用。所以闡明 ESCC 的轉(zhuǎn)錄組特征和微環(huán)境成分，對(duì)制定有效的早期診斷和治療策略是非常重要的。
·研究思路
·研究結(jié)果
01、繪制 ESCC 腫瘤微環(huán)境圖譜
對(duì)60例 ESCC 患者的腫瘤組織和4例正常組織進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄測(cè)序（CD45-細(xì)胞）和 TCR 測(cè)序（CD45+?細(xì)胞），并使用經(jīng)典的 marker 基因進(jìn)行注釋（圖1a）。從 CD45-?細(xì)胞中鑒定了8個(gè)主要細(xì)胞群：上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞，在 CD45+?細(xì)胞中鑒定了 T 細(xì)胞、B 細(xì)胞和髓樣細(xì)胞。與正常組織相比，ESCC 腫瘤組織有更多的上皮細(xì)胞和周細(xì)胞，但成纖維細(xì)胞較少（圖1b，1c）。
02、上皮細(xì)胞的瘤內(nèi)和瘤間異質(zhì)性
作者先研究 ESCC 中上皮細(xì)胞的表達(dá)狀態(tài)，將52個(gè)患者的上皮細(xì)胞重新聚類(lèi)分成38個(gè)亞群（圖2a），并分析每個(gè)亞群在不同患者的比例，發(fā)現(xiàn)其中24個(gè)細(xì)胞亞群（≥75%）來(lái)自單個(gè)患者，而其他14個(gè)亞群則由多個(gè)患者構(gòu)成（圖2b）。作者將上述24個(gè)亞群定義為第1組亞群，另外14個(gè)亞群定義為第2組亞群。比較每名 ESCC 患者的上皮組成成分，發(fā)現(xiàn)其中21例患者的 ESCC 主要由第1組亞群組成，31例患者由第2組亞群組成（圖2c），另外使用 PCA 分析上皮細(xì)胞在腫瘤內(nèi)和腫瘤間的異質(zhì)性（圖2d），上述結(jié)果表明 ESCC 廣泛存在腫瘤內(nèi)和腫瘤間異質(zhì)性且是正相關(guān)（圖2e）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)第1組亞群比第2組亞群具有更高的腫瘤間異質(zhì)性（圖2f）。
03、ESCC 上皮細(xì)胞中八種常見(jiàn)表達(dá)程序
為了研究多個(gè)樣本之間上皮細(xì)胞的共表達(dá)程序，對(duì)每個(gè)樣本內(nèi)部重新進(jìn)行聚類(lèi)分成274個(gè)亞群（圖3a）?；诿總€(gè)亞群的 top30 基因進(jìn)行層次聚類(lèi)分析，共鑒定了8個(gè)具有不同功能和細(xì)胞狀態(tài)的表達(dá)程序（圖3b）。通過(guò) GSVA 對(duì)表達(dá)程序細(xì)胞進(jìn)行富集分析，發(fā)現(xiàn)不同的表達(dá)程序具有不同的生物學(xué)功能（圖3c），通過(guò)相關(guān)性分析不同表達(dá)程序之間的相互作用，確定了5個(gè)顯著的共現(xiàn)程序，Epi1 與 Epi2 高度共存，反映了 Epi1 和 Epi2 對(duì)上皮細(xì)胞分化的需求，Epi1 也與循環(huán)程序同時(shí)發(fā)生，反映了 Epi1 對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖途徑的激活。Epi2 程序與粘膜程序高度共存，表明粘膜免疫存在于分化良好的上皮細(xì)胞中（圖3d）。最后對(duì)8個(gè)表達(dá)程序進(jìn)行打分以及對(duì)患者進(jìn)行聚類(lèi)，發(fā)現(xiàn)每個(gè)表達(dá)程序在 ESCC 患者之間高度不均一，大多數(shù) ESCC 患者表達(dá)不止一個(gè)程序（圖3f）。
04、ESCC 的免疫抑制型腫瘤微環(huán)境
由于 T 細(xì)胞是 TME 中最豐富的腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞，因此重新聚集分析69278個(gè) T 細(xì)胞，共分成9種不同的細(xì)胞亞群，與正常組織相比，ESCC 的 TME 中富含調(diào)節(jié) T 細(xì)胞和耗竭 T 細(xì)胞，缺少初始、效應(yīng)和記憶 T 細(xì)胞，表明 TME 處于免疫抑制狀態(tài)（圖4a）。與 I 期腫瘤相比，II/III 期 ESCC 的衰竭和 Treg 評(píng)分顯著升高，說(shuō)明 ESCC 的 TME 免疫抑制狀態(tài)隨著腫瘤進(jìn)展而惡化（圖4b）。另外 TCR 分析顯示，TCR 克隆型組成和增殖細(xì)胞比例在不同的 T 細(xì)胞亞型中高度不同，耗竭 T 細(xì)胞具有最高的克隆擴(kuò)增水平和增殖細(xì)胞比例（圖4c，4d）。
由于腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（Tumor associated macrophages , TAMs）已被證明是調(diào)節(jié)先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)以及促進(jìn)腫瘤血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，因此對(duì)19273個(gè)髓系細(xì)胞重新分群成11種不同的細(xì)胞亞群（圖4e），發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞和 TAMs 不僅表達(dá)與免疫抑制相關(guān)的基因（TGFB1?和?COX2），而且還表達(dá)與血管生成相關(guān)的基因（VEGFA、CXCL8、MMP9和?MMP12）（圖4f）。樹(shù)突狀細(xì)胞（Dendritic Cells , DC）有三種不同的細(xì)胞亞型：經(jīng)典 DC (cDC)、耐受性 DC（tDC）和漿細(xì)胞樣 DC（pDC），其中免疫檢查點(diǎn)基因 PD-L1、PD-L2 和 IDO1 在 tDC 中表達(dá)量最高（圖4g），另外 ESCC 顯著富集 tDC，且 PD-L1、PD-L2 的表達(dá)高于與正常組織（圖4h）。另外從一名 ESCC 患者組織中分離的 tDC 與人外周血的 CD8+?T 細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn) tDC 顯著抑制 CD8+?T 細(xì)胞的增殖，在加入 PD-L1 抗體后，可恢復(fù) CD8+?T 細(xì)胞的增殖和活化（圖4i，4j）。上述結(jié)果表明 tDC 在 ESCC 免疫抑制微環(huán)境中起著至關(guān)重要的作用。
05、ESCC 基質(zhì)細(xì)胞的互作和分化
成纖維細(xì)胞和周細(xì)胞可通過(guò)周細(xì)胞-成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞，是 TME 的重要的組成部分，可促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。因此作者將成纖維細(xì)胞和周細(xì)胞重新聚類(lèi)分為9個(gè)亞群（圖5a）。這些成纖維細(xì)胞亞群具有不同的標(biāo)記基因和通路活性，NMF 表達(dá)編碼蛋白酶抑制劑相關(guān)的的基因（SLPI 和 PI16），NAF1/2 表達(dá)與傷口愈合反應(yīng)相關(guān)基因（IGF1、C7 和 APOD），CAF1 和 CAF2 表達(dá)促炎趨化因子（CXCL1 和 CXCL6），另外 CAF1 也高表達(dá)（CCL2、CCL11 和 CXCL14）, CAF2 高表達(dá)活化周細(xì)胞的細(xì)胞因子（CXCL5 和 CXCL8），CAF3 和 CAF4 則高表達(dá)肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志基因（TAGLN 和 ACTA2)（圖5b）。另外作者發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞兩種不同發(fā)育軌跡，在一個(gè)分支中發(fā)現(xiàn)從 NMF 到 NAF1/2、CAF1、CAF3 和 CAF4 的分化軌跡，另一個(gè)分支發(fā)現(xiàn)周細(xì)胞、CAF2 和 CAF4 的分化軌跡（圖5c）?；诜謪^(qū)的圖抽象（PAGA）分析不同亞群之間相互作用，發(fā)現(xiàn) CAF1 與 NAFs 和 CAF4 相關(guān)，而 CAF3 則是與 CAF2 和 CAF4 之間的聯(lián)系更加密切（圖5d）。與正常組織相比，腫瘤組織中高 CAF2、CAF3、CAF4、周細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞，其中 II/III 期 ESCC 比 I 期表達(dá)更多的 CAF3 和 CAF4（圖5e）。上述結(jié)果表明在 ESCC 微環(huán)境中，CAFs 的積累可能在腫瘤進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。
由于內(nèi)皮細(xì)胞（Endothelial Cell , EC）在 TME 中經(jīng)常表現(xiàn)出異常的表型和功能，這可能會(huì)限制它們對(duì)抗血管生成療法的反應(yīng)，因此將11267個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞重新聚類(lèi)為6個(gè)亞群，包括3個(gè)正常 EC（NEC1-NEC3）和3個(gè)腫瘤 EC（TEC1-TEC3）（圖5f），通過(guò)聚類(lèi)熱圖發(fā)現(xiàn) TECs 具有特異性激活的通路，包括細(xì)胞增殖、血管生成、TGF-β 信號(hào)傳導(dǎo)、EMT 和能量代謝（圖5g）。另外 TECs 高表達(dá)與血管生成相關(guān)的分子（VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3和PDGFB），但與細(xì)胞粘附相關(guān)的基因（ICAM1 和 VCAM1）表達(dá)水平則低于 NECs（圖5h）。
PDGFB-PDGFRB 信號(hào)通路在周細(xì)胞-肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化中起著關(guān)鍵作用，且 PDGFB 主要由內(nèi)皮細(xì)胞分泌，通過(guò)配體-受體互作分析發(fā)現(xiàn)，TEC 和周細(xì)胞之間有很強(qiáng)的相互作用（5i），TEC 中 FDGFB 的表達(dá)水平與周細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞比值、CAF2 和 CAF4 比例呈正相關(guān)（圖5j，5k）。上述結(jié)果表明，TEC 可能通過(guò)誘導(dǎo)周細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，促進(jìn)腫瘤血管生成，從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。
·研究結(jié)論
本研究對(duì)60個(gè) ESCC 患者和4例正常組織的208659個(gè)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，揭示了 ESCC 的 TME 組成。闡明了腫瘤細(xì)胞和 TME 細(xì)胞之間可能的相互作用以及 TME 中不同細(xì)胞類(lèi)型之間的相互作用，這些結(jié)果揭示 ESCC 的 TME 免疫抑制狀況，為深入了解 ESCC 的發(fā)病和進(jìn)展機(jī)制提供了基礎(chǔ)。
參考文獻(xiàn)：
ZhangX, Peng L, Luo Y, et al. Dissecting esophageal squamous-cell carcinoma ecosystem by single-cell transcriptomic analysis.?Nat Commun. https:2021;12(1):5291.doi:10.1038/s41467-021-25539-x.
