第二章 微型裸腹溞孤雌溞和有性雌溞RNA-seq與iTRAQ蛋白分析

2.1 前言

微型裸腹溞（Moina micrura）隸屬節(jié)肢動(dòng)物門（Arthropoda）、甲殼綱（Crustacea）、鰓足亞綱（Branchiopoda）、雙甲目（Diplostraca）、枝角亞目（Cladocera）、裸腹溞科（Moinidae），是一種具有豐富的形態(tài)和生態(tài)可塑性的世界性分支動(dòng)物，分布在世界的溫帶、熱帶和亞熱帶地區(qū)（Murugan 2006）。微型裸腹溞是魚類幼體的理想活餌料和經(jīng)濟(jì)上重要的甲殼類動(dòng)物，可作為評(píng)估水生生態(tài)系統(tǒng)水質(zhì)的指標(biāo)（Arauzo and Valladolid 2003）。

與其他枝角類一樣，微型裸腹溞也行周期性的孤雌生殖，能夠誘導(dǎo)微型裸腹溞進(jìn)行有性生殖的條件多種多樣，包括密度、溫度、食物質(zhì)量和數(shù)量以及光照周期等（Fernando et al 2007）。Crosetti和Margaritora 研究表明微型裸腹溞的有性生殖可能是由溫度和光照周期以及競爭誘導(dǎo)（Crosetti and Margaritora 1987）。Fernando等發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)體積是其進(jìn)行有性生殖的重要誘因（Fernando et al 2007）。Jana和Pal確定食物質(zhì)量對(duì)微型裸腹溞的生長和繁殖有很大的影響（Jana and Pal 1985）。微型裸腹溞休眠卵的產(chǎn)生是在有雄性存在且食物供應(yīng)不足的高密度培養(yǎng)條件下，高密度雖然可以誘導(dǎo)雄性的產(chǎn)生，但并不是誘導(dǎo)休眠卵產(chǎn)生的充分的應(yīng)激因子；類似地，單純的食物限制并不會(huì)誘導(dǎo)雄性和休眠卵的產(chǎn)生，是需要高密度的協(xié)同作用（Osman et al 2013）。

在生態(tài)學(xué)中，微型裸腹溞這種生殖可塑性倍受關(guān)注，但對(duì)其生殖轉(zhuǎn)化調(diào)控的分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)還很缺乏。使用分子工具探究微型裸腹溞某些分子單元在生長和生殖調(diào)控中的潛在作用是很有必要的。

高通量測(cè)序技術(shù)可以分析一個(gè)有機(jī)體在響應(yīng)環(huán)境壓力過程中全部分子譜的變化。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-Seq）是一種轉(zhuǎn)錄定量技術(shù)，且已經(jīng)被成功地應(yīng)用于基因注釋、表達(dá)分析和轉(zhuǎn)錄本分析(Yang et al 2011)。同樣，蛋白組是一種用于解決基因組序列無法提供基因功能注釋的高通量方法，是確定基因功能的最直接的方法（Ahsan et al 2008）。同位素相對(duì)標(biāo)記與絕對(duì)定量技術(shù)（iTRAQ）相對(duì)于低通量蛋白組學(xué)方法（如傳統(tǒng)的二維凝膠方法）是第二代無凝膠蛋白組學(xué)，可以更精確的進(jìn)行蛋白定量。目前還沒有發(fā)現(xiàn)有對(duì)環(huán)境脅迫下參與生殖轉(zhuǎn)化的蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析的研究。

本章的目的是進(jìn)一步研究與枝角類生殖轉(zhuǎn)化有關(guān)的關(guān)鍵基因及其蛋白質(zhì)產(chǎn)物。為了實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，以微型裸腹溞作為模型，使用RNA-Seq和iTRAQ技術(shù)鑒定有性生殖雌溞（SF）和孤雌生殖雌溞（PF）之間差異表達(dá)的mRNA和蛋白質(zhì)。這些研究將為枝角類生殖轉(zhuǎn)換分子機(jī)制的研究提供重要信息。

2.2 材料與方法

2.2.1 樣品準(zhǔn)備

微型裸腹溞采集于南湖（中國，武漢），并在實(shí)驗(yàn)室通過單克隆培養(yǎng)建立純系。健康且有活力的孤雌生殖雌溞已經(jīng)在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)1年，培養(yǎng)溫度設(shè)置為25℃，光照周期為光：暗=12 h：12 h，飼喂食物為小球藻。根據(jù)微型裸腹溞的生物學(xué)特征，當(dāng)種群密度達(dá)到一定水平就會(huì)發(fā)生生殖轉(zhuǎn)化，使用顯微鏡確定它們的生殖狀態(tài)，分別收集健康有活力的有性生殖雌溞（SF）和孤雌生殖雌溞（PF）（圖2-1），并將它們放入凍存管中（100只/管）。用無菌純水將凍存管中的樣品清洗2~3次，吸干水分后放入液氮中速凍，之后存放于-80℃。本研究分別采集6管有性生殖雌溞和孤雌生殖雌溞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和蛋白組測(cè)序。

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2.2.2 主要儀器和試劑

1）主要儀器：梯度PCR儀L96G（杭州朗基科學(xué)儀器有限公司），微量移液器（Eppendorf），凝膠成像分析系統(tǒng)（Syngene），DYY-III型電泳儀及水平電泳槽（北京六一儀器廠），臺(tái)式低溫高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf），超凈工作臺(tái)（江蘇蘇凈集團(tuán)有限公司），恒溫水浴鍋（北京六一儀器廠），GZX-III系列光照培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司），組織研磨器TissueLyser II（QIAGEN），實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ThermoFisher Scientific），NanoDrop 2000分光光度計(jì)（賽默飛）等。

2）主要試劑：PCR反應(yīng)試劑（rTaq酶，dNTP等）（Takara），Trizol（上海翊圣生物科技有限公司），DL2000 DNA Marker（Takara），蛋白酶抑制劑（Thermo, United States），PrimeScript RT reagent kit（Takara）等。

2.2.3 總RNA提取和cDNA文庫構(gòu)建

使用TRIzol試劑分別提取SF和PF的總RNA，并且使用DNase I去除基因組DNA。利用Nanodrop 2000分光光度計(jì)評(píng)估樣品純度和RNA濃度，并使用RNA 6000 Nano kit在安捷倫2100型生物分析儀上分析RNA的質(zhì)量。所有樣品的260/280比率都大于2.0并且RIN值≥7.5。在構(gòu)建文庫之前，去除核糖體和病毒RNA，并且用磁性O(shè)ligo-dT珠（Invitrogen, United States）分離poly(A)+ mRNA。然后使用Illumina（San Diego, CA, United States）的TruSeq^TM RNA sample preparation Kit將每種樣品的10 μg總RNA用于構(gòu)建文庫，所有的操作均按照Illumina協(xié)議進(jìn)行。此后，將構(gòu)建好的測(cè)序文庫在Illumina HiSeq^TM 2000（Majorbio Biotech Co., Ltd. Shanghai, China）系統(tǒng)中上機(jī)測(cè)序。

2.2.4 轉(zhuǎn)錄組De novo組裝和生物信息學(xué)分析

原始雙端測(cè)序reads由SeqPrep和Sickle以默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行修剪和質(zhì)控。然后使用Trinity將來自SF和PF樣品的高質(zhì)量數(shù)據(jù)（clean data）進(jìn)行de novo組裝，并且所有組裝的全長序列被命名為unigenes（Grabherr et al 2011）。將所有得到的unigenes針對(duì)NR、Swiss-Prot、COG和KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blastx搜索和注釋（Camacho et al 2009）。使用Blast2GO軟件（Conesa et al 2005）進(jìn)行GO的功能注釋，并使用WEGO軟件對(duì)unigenes進(jìn)行功能分類（Ye et al 2006）?；虮磉_(dá)量read counts被進(jìn)一步標(biāo)準(zhǔn)化為FPKM（Fragments per kilobase of exon per million reads mapped）值。通過使用RSEM軟件（v 1.2.7）（Li and Dewey 2011）計(jì)算表達(dá)量倍數(shù)變化，并使用R Bioconductor包edgeR分析差異表達(dá)基因（DEG）（Robinson et al 2010）。P-value設(shè)定為差異表達(dá)基因的閾值，在多重檢驗(yàn)中P-value的閾值由FDR（False Discovery Rate）的值確定（Benjamini and Yekutieli 2001）。以FDR≤0.001且差異倍數(shù)不低于2倍為標(biāo)準(zhǔn)篩選兩個(gè)不同樣本的差異表達(dá)基因（DEGs）。

2.2.5 蛋白質(zhì)制備和iTRAQ標(biāo)記

將微型裸腹溞的凍存樣本置于冰上，加入1:10比例蛋白裂解緩沖液（8 M 尿素，0.3% SDS）和適量蛋白酶抑制劑（Thermo, United States），混勻后將樣本轉(zhuǎn)移到Lysing Matrix Tubes振蕩管中，使用高通量組織研磨儀震蕩研磨4次；冰上裂解30 min；4℃，16000 g離心30 min，取上清。將蛋白質(zhì)（每個(gè)樣品200 μg，用裂解液將體積補(bǔ)充至200 μL）用10 mM TCEP（Thermo, USA）（最終濃度）在37℃還原1 h，并用40 mM碘乙酰胺（Sigma, USA）在暗室里烷基化40 min。在-20℃下加入6倍體積的冷卻丙酮沉淀還原和烷基化的蛋白質(zhì)混合物4 h；在4℃，10,000 g，離心20 min后，將沉淀物溶于200 μL 100 mM TEAB（Applied Biosystems, Milan, Italy）中，用胰蛋白酶（Promega, Beijing, China）（胰蛋白酶：蛋白質(zhì)=1:50）在37℃下消化蛋白質(zhì)12 h，并等分為兩等份。胰蛋白酶消化后，通過旋轉(zhuǎn)真空離心（Christ RVC 2-25, Christ, Germany）干燥多肽，再溶解于0.4 M TEAB中，并根據(jù)8-plex iTRAQ試劑（AB SCIEX，USA）的制造商指南進(jìn)行處理。將樣品以SF和PF的iTRAQ標(biāo)簽標(biāo)記，用等量異位標(biāo)簽標(biāo)記多肽并在室溫下孵育2 h，合并標(biāo)記的多肽混合物并通過真空濃縮器干燥。

2.2.6 LC/LC-MS/MS分析

用上樣緩沖液[含有2%乙腈（ACN）的5 mM甲酸銨，pH=10]重懸每個(gè)部分；并通過高pH反相液相色譜（RPLC, Acquity Ultra Performance LC; Waters, Milford, MA）分離。溶劑A和溶劑B分別為2% ACN（pH=10，通過氨調(diào)節(jié)）和80% ACN（pH=10，通過氨調(diào)節(jié)）。在高pH RPLC柱（C18, 1.7 μm, 2.1 mm × 150 mm; Waters, USA）上用0%至30%溶劑B（2~38 min）和30%至100%溶劑B（38~40 min）進(jìn)行梯度洗脫。用Nano Aquity UPLC系統(tǒng)（Waters Corporation, Milford, MA）對(duì)收集的所有級(jí)分進(jìn)行LC-MS/MS分析，該系統(tǒng)連接到配備在線納米電噴霧離子源的Q-Exactive四極-軌道雜化質(zhì)譜儀（Thermo, USA）。將4 μL多肽樣品加載到Thermo Scientific Acclaim PepMap C18柱（75 μm × 25 cm; 1.7 μm粒徑）上，流速為300 nL/min，持續(xù)1 min，然后用分析柱（Acclaim PepMapC18, 75 μm × 25cm）在89 min內(nèi)以5%至100%的溶劑B進(jìn)行線性梯度分離，最后在溶劑B為100%時(shí)持續(xù)6 min。用于分離的溶劑A和溶劑B分別是含有0.1%甲酸的2% ACN和含有0.1%甲酸的80% ACN。將柱在初始條件下重新平衡30 min。柱流速保持在300 nL/min，溫度保持在40℃，使用1.9 kV的電噴霧電壓。Q-Exactive質(zhì)譜儀在數(shù)據(jù)依賴性模式下工作，實(shí)現(xiàn)MS與MS/MS采集的自動(dòng)切換。獲得質(zhì)量分辨率為70 K的全掃描MS光譜（m/z 350~1300），然后進(jìn)行分辨率為17.5 K的MS/MS掃描。

2.2.7 蛋白質(zhì)的鑒定分析

使用Proteome Discoverer^TM Software 2.1（Thermo, United States）處理從LC/LC-MS/MS分析中獲得的原始數(shù)據(jù)。搜索參數(shù)包括：將uniprot organism 6669-D. pulex作為蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫；Iodoacetamide作為Cys烷基化；氧化（M）、乙?；ǖ鞍踪|(zhì)N末端）和iTRAQ8plex（Y）作為潛在的動(dòng)態(tài)修飾；iTRAQ8plex（K）和iTRAQ8plex（N-末端）作為靜態(tài)修飾。使用針對(duì)NR數(shù)據(jù)庫的Blast2GO程序進(jìn)行蛋白質(zhì)的功能注釋，并將不同注釋的蛋白質(zhì)進(jìn)一步匹配至KEGG數(shù)據(jù)庫。使用R語言中的t檢驗(yàn)函數(shù)計(jì)算樣本之間差異的顯著P-value。為了確定顯著上調(diào)或下調(diào)的蛋白質(zhì)，將SF/PF或PF/SF比值的閾值設(shè)置為≥1.50或≤0.67（≥1.5倍）且P-value<0.05。

2.2.8 轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)的相關(guān)性分析

為了評(píng)估m(xù)RNA和蛋白質(zhì)之間定量信息的潛在相關(guān)性，使用截?cái)嘀担―EGs：|倍數(shù)變化（FC）|>2.0和FDR<0.001；DEPs：p值<0.05和|FC|≥1.50）篩選具有明顯差異表達(dá)的mRNA和蛋白質(zhì)。然后，我們使用RNA-seq數(shù)據(jù)作為可搜索的數(shù)據(jù)庫，分析所有鑒定的蛋白質(zhì)序列并用RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行搜索查詢。為了進(jìn)一步挖掘蛋白質(zhì)組的有效信息，在DEPs和整個(gè)轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)庫之間也進(jìn)行了相關(guān)性分析。

2.2.9 RT-qPCR驗(yàn)證

分別使用TRIzol試劑從SF和PF樣品中提取總RNA。使用Nanodrop 2000分光光度計(jì)評(píng)估樣品純度和RNA濃度，使用PrimeScript RT reagent kit（Takara）分別將PF和SF的10 μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。使用針對(duì)DEGs的特異性引物在ABI 7500 real-time PCR系統(tǒng)上（Applied Biosystems，United States）對(duì)獲得的RT樣品進(jìn)行qPCR。引物序列和反應(yīng)體系見表2-1和2-2，采用三步法進(jìn)行RT-qPCR，具體如下：預(yù)變性95℃ 10 min，接著36個(gè)循環(huán)包括變性95℃ 15 sec，64℃退火30 sec及72℃延伸30 sec。在基因表達(dá)量分析中，以GAPDH基因的表達(dá)作為內(nèi)參對(duì)照，使用QuantStudioReal-Time PCR軟件和2-^ΔΔCt方法分析目的基因的相對(duì)表達(dá)量（Livak and Schmittgen 2001）。

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2.2.10 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。生理學(xué)數(shù)據(jù)采用Student’s t-檢驗(yàn)和Tukey方法進(jìn)行95%置信水平下的單因素方差分析。使用Student’s t-test評(píng)估RT-PCR結(jié)果，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（SEM）。當(dāng)P<0.05時(shí)，實(shí)驗(yàn)組之間的差異被認(rèn)為是顯著的。

2.3 結(jié)果

2.3.1 RNA-Seq數(shù)據(jù)和DEGs的鑒定

利用RNA-Seq技術(shù)來比較SF和PF之間的mRNA表達(dá)譜，以SF和PF建立2個(gè)文庫，分別獲得77,923,354和68,509,476條clean reads，read length為145 bp，所有Q30均高于96%。在質(zhì)控后獲得了平均長度為995 bp的69,857個(gè)unigenes。在這些unigenes中，分別有20,131（28.8%）、24,282（34.8%）、8,807（12.6%）、24,543（35.1%）和13,213（18.9%）個(gè)unigenes被注釋到NR、Swiss-prot、KEGG、COG和GO數(shù)據(jù)庫。此外，F(xiàn)PKM分析表明在SF和PF之間總共有1665個(gè)unigenes（FC>2.0和FDR<0.001）顯著差異表達(dá)。與PF相比，SF中有963個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，702個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。

2.3.2 GO和KEGG pathway富集分析

為了進(jìn)一步探索DEGs在宏觀水平上的分布，對(duì)SF和PF中的DEGs集分別進(jìn)行了GO和KEGG pathway富集分析。GO富集分析表明：在SF中上調(diào)的基因與表皮高度相關(guān)（如多糖結(jié)合、幾丁質(zhì)結(jié)合、表皮結(jié)構(gòu)成分等）、血紅蛋白（如鐵離子結(jié)合、血紅素結(jié)合和四吡咯結(jié)合）、氧化應(yīng)激（如氧化還原酶活性和氧化還原過程）和卵黃原蛋白（如脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性）；而在SF中下調(diào)的大多數(shù)基因主要富集在代謝過程（如大分子/雜環(huán)/氨基糖聚糖代謝過程）、主要代謝過程（如蛋白質(zhì)代謝過程、蛋白水解和碳水化合物/多糖代謝過程）、催化活性（如水解酶活性和轉(zhuǎn)移酶活性）和肽酶活性（如內(nèi)肽酶活性和絲氨酸型肽酶/內(nèi)肽酶活性）（圖2-2）。KEGG pathway富集分析表明：在SF中大多數(shù)上調(diào)的基因與生物體系統(tǒng)（如長壽調(diào)節(jié)途徑、PPAR信號(hào)傳導(dǎo)途徑等）和代謝（如檸檬酸循環(huán)、戊糖和葡糖醛酸交換等）廣泛相關(guān)；而生物系統(tǒng)（如蛋白質(zhì)消化和吸收、溶酶體等）和環(huán)境信息處理（如神經(jīng)活性配體-受體相互作用和鞘脂信號(hào)通路）是下調(diào)基因主要富集的pathway（圖2-3）。

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2.3.3 微型裸腹溞中生殖轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵DEGs

為了進(jìn)一步探索微型裸腹溞的生殖轉(zhuǎn)化機(jī)制，共篩選出1665個(gè)DEGs，在SF中分別鑒定出120個(gè)上調(diào)基因和103個(gè)下調(diào)基因（SF vs. PF; FC≥100）。在SF上調(diào)的DEGs中，進(jìn)一步確定了一些可能與生殖轉(zhuǎn)化相關(guān)的關(guān)鍵基因，如chitotriosidase-1 （Chit1）、probable chitinase 3（Cht3）、ATP-dependent RNA helicase DDX54（Ddx54）、hemoglobin、phosphatidylethanolamine-binding protein homolog F40A3.3（F40A3.3）、Vg、protein-lysine N-methyltransferase Mettl10（Mettl10）、alpha-crystallin A chain（Cryacra）、heat shock protein Hsp-16.2（Hsp16.2）、sex-lethal homolog（Sxl）、endocuticle structural glycoprotein SgAbd-8（SgAbd-8）、cuticle protein 6（CP6）、cuticle protein 7（CP7）和pupal cuticle protein 27（Pcp27）(表2-3).

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3.3.4 蛋白質(zhì)的鑒定與定量

Q-Exactive質(zhì)譜儀具有高分辨率和高準(zhǔn)確度的優(yōu)勢(shì)，用來檢測(cè)SF和PF之間的差異表達(dá)蛋白（DEPs）。結(jié)果表明：有2352個(gè)蛋白質(zhì)在Proteome Discoverer中命中；在數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)的肽片段的匹配誤差低于0.05Da（圖2-4 A）；大多數(shù)蛋白質(zhì)的分子量分布在21-60 kDa（圖2-4 B）；肽長度約為9-20 aa，峰值區(qū)域在9-15 a（圖2-4 C）；鑒定到蛋白質(zhì)中的肽的數(shù)量如圖2-4 C所示，大多數(shù)蛋白質(zhì)序列覆蓋率為1-40%。

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2.3.5 DEPs的鑒定和富集分析

在SF和PF中共鑒定出600個(gè)DEPs（FC≥1.5且p-value<0.05），包括在SF中上調(diào)的102個(gè)蛋白質(zhì)和下調(diào)的498個(gè)蛋白質(zhì)。GO分析表明：大多數(shù)DEPs功能分布在細(xì)胞組分（如細(xì)胞部分、大分子復(fù)合物等）、結(jié)合、細(xì)胞過程和代謝過程；此外在SF中大多數(shù)上調(diào)的DEPs主要與發(fā)育過程和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子活性相關(guān)（圖2-5）。除GO分析外，還進(jìn)行了KEGG pathway富集分析，用于進(jìn)一步闡明這些DEPs的假定功能，結(jié)果表明：在SF中上調(diào)的蛋白質(zhì)主要參與遺傳信息處理通路，特別是與真核生物中RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、核糖體和核糖體生物發(fā)生有關(guān)的翻譯過程，而下調(diào)基因主要富集的通路只發(fā)現(xiàn)核糖體（圖2-6）。

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2.3.6 微型裸腹溞中生殖轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵DEPs

為了進(jìn)一步探究微型裸腹溞的生殖轉(zhuǎn)化機(jī)制，在SF中鑒定出50個(gè)上調(diào)蛋白（FC≥1.5）和130個(gè)下調(diào)蛋白（FC≥1.6）。在SF上調(diào)的DEPs中，進(jìn)一步確定了一些可能與生殖轉(zhuǎn)化有關(guān)的關(guān)鍵蛋白，包括bolA-like protein（G0274169）、ferritin subunit（Ferh）、hemoglobin、cytoglobin-2（Cygb2）、Vg、Vg2、protein-lysine N-methyltransferase Mettl10（Mettl10）、NADH dehydrogenase 1 alpha subcomplex assembly factor 5（Ndufaf5）、heat shock protein（ECU02_0100）、heat shock protein （Hsp-16.2）和 pupal cuticle protein 20（Pcp20）(表2-4)。

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2.3.7 SF和PF之間轉(zhuǎn)錄組與蛋白組數(shù)據(jù)相關(guān)分析

如圖2-7 A所示，在蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄本水平上共鑒定出2352個(gè)基因，然而，僅有72個(gè)DEPs在轉(zhuǎn)錄本水平也同時(shí)檢測(cè)到（圖2-7 B）。Pearson相關(guān)系數(shù)為-0.1542（P<0.01，圖2-7 C），這表明轉(zhuǎn)錄水平的基因相對(duì)表達(dá)量與蛋白質(zhì)水平正相關(guān)但不強(qiáng)。GO分析表明：主要的GO 條目分別集中于結(jié)合、代謝過程、催化活性、細(xì)胞過程和單組織過程（圖2-7 D）。此外，在最顯著富集的通路中，大多數(shù)DEGs聚集在代謝途徑、核糖體和蛋白質(zhì)消化和吸收中，而DEPs主要富集通路是核糖體、核糖體生物發(fā)生、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)和剪接體（圖2-7 E）。

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基于轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性分析，在SF中共有15個(gè)上調(diào)基因和16個(gè)下調(diào)基因（具有功能注釋）在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平上均有表達(dá)。這些上調(diào)基因包括Amy2、Cryaa、Ddb_G0274169、Cdipt、hemoglobin、Vg、Vg2、Mettl10、Vat1L、Kcp、Hsp-16.2、Gpx3、SgAbd-8、Rps26和Sod1（表2-5）；下調(diào)基因包括Tsr、Sec5、Man2B1、EFE4、Smpd1、Etfa、Nup155、Ebna1Bp2、Lolal、Anpep、Zetatry、CpipJ_CPIJ014254、Rps17、Ugt2B31、Aael007945和FABP（表2-6）。

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轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)之間的比較表明蛋白質(zhì)的表達(dá)模式與其在轉(zhuǎn)錄水平上的mRNA表達(dá)模式顯示出一般相關(guān)性。而這些數(shù)據(jù)還揭示了轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平之間的顯著不一致。在蛋白水平上發(fā)現(xiàn)SF中有59個(gè)上調(diào)蛋白（FC>1.5）（具有功能注釋）和469個(gè)下調(diào)蛋白（FC>1.8），但在轉(zhuǎn)錄水平mRNA表達(dá)無變化，另外，4個(gè)上調(diào)蛋白和11個(gè)下調(diào)蛋白顯示出與轉(zhuǎn)錄水平相反的豐度變化（圖2-8）。

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2.3.8 RT-qPCR驗(yàn)證候選基因

為了進(jìn)一步確認(rèn)轉(zhuǎn)錄組和蛋白組數(shù)據(jù)結(jié)果，隨機(jī)選取21個(gè)DEGs或DEPs進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證，包括在SF中的11個(gè)上調(diào)DEGs或DEPs（Amy2、Cryaa、Ddb_Gg0274169、Hemoglobin、Vg、Vg2、Hsp-16.2、Gpx3、SgAbd-8、Mettl10和Sod1）和在PF中的10個(gè)上調(diào)DEGs或DEPs（Tsr、Sec5、Man2B1、Nup155、Ebna1Bp2、Anpep、Zetatry、Rps17、Aael007945和Ugt2B31）。結(jié)果表明：這21個(gè)DEGs或DEPs的表達(dá)譜與高通量測(cè)序結(jié)果基本一致（表2-11）。

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2.4 討論

與其他枝角類一樣，微型裸腹溞也可以將它們的生殖方式從孤雌生殖轉(zhuǎn)換為有性生殖以適應(yīng)外部環(huán)境。但關(guān)于生殖轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制知之甚少。在本研究中，基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析，試圖研究微型裸腹溞（SF vs. PF）中的DEGs和DEPs，并鑒定參與生殖轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵基因或其蛋白產(chǎn)物。

GO和KEGG富集分析表明微型裸腹溞中的上調(diào)和下調(diào)基因具有不同的富集條目。在SF中富集條目主要是表皮相關(guān)（如多糖結(jié)合、幾丁質(zhì)結(jié)合、表皮的結(jié)構(gòu)成分等）、血紅蛋白（如鐵離子結(jié)合、血紅素結(jié)合和四吡咯結(jié)合）和氧化應(yīng)激（如氧化還原酶活性和氧化還原過程）。幾丁質(zhì)參與昆蟲的表皮形成，是抵抗任何環(huán)境脅迫的最重要的組織屏障（Pesch et al 2016），血紅蛋白能讓生物體在低氧脅迫下存活（Pirow et al 2001）。這些結(jié)果表明，SF中上調(diào)的基因?qū)π纬煽共焕麠l件的保護(hù)性表皮結(jié)構(gòu)、增加缺氧條件下氧的輸送和儲(chǔ)存具有重要作用。相反，在PF中主要富集的是基本代謝過程（如代謝過程、大分子代謝過程和蛋白質(zhì)代謝過程）。眾所周知，PF可以產(chǎn)生大量孤雌胚胎，這些胚胎可以在不受精的情況下直接發(fā)育成成體（Arbaciauskas 2004），這些結(jié)果意味著PF中各種代謝過程的上調(diào)可能在營養(yǎng)攝取中起重要作用，以進(jìn)一步促進(jìn)新生兒的成長。

轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組之間的相關(guān)性分析表明蛋白質(zhì)在不同GO條目中的富集與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致。然而，蛋白質(zhì)中富集的通路主要為遺傳信息處理通路，而在轉(zhuǎn)錄水平中占主導(dǎo)地位的是各種代謝過程。此外，目前的研究表明31個(gè)基因在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平上均顯著差異表達(dá)，包括16個(gè)上調(diào)基因和15個(gè)下調(diào)基因。盡管轉(zhuǎn)錄調(diào)控和翻譯調(diào)控通常是協(xié)調(diào)一致的，但也發(fā)現(xiàn)了許多與這一趨勢(shì)相反的基因，在SF中共有543個(gè)DEPs表現(xiàn)出與轉(zhuǎn)錄水平不同表達(dá)模式，這意味著轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的參與。先前的研究表明轉(zhuǎn)錄后加工決定穩(wěn)態(tài)蛋白水平（Chen and Harmon 2006）。為了進(jìn)一步探討轉(zhuǎn)錄后調(diào)控對(duì)生殖轉(zhuǎn)化的影響，還挖掘出一些在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平調(diào)控趨勢(shì)相反的蛋白質(zhì)，包括Dmagvtg1、Ferh、Cat-1、Ndufaf5、Pxt、cuticle protein 7、Cygb2、endocuticle structural glycoprotein SgAbd-2、Cyp301a1、Pcp20、Ecu02_0100、ferritin heavy chain和Apod。在微型裸腹溞的生殖轉(zhuǎn)化中，這些轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的基因比那些轉(zhuǎn)錄調(diào)控的基因可能發(fā)揮著更重要的作用。下面對(duì)涉及生殖轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵基因及其蛋白質(zhì)產(chǎn)物進(jìn)行分類分析。

1）氧氣輸送相關(guān)基因

球蛋白是一個(gè)含有血紅素的球狀蛋白的超級(jí)家族，參與結(jié)合和/或運(yùn)輸氧氣，特別是鐵離子結(jié)合、血紅素結(jié)合和氧氣運(yùn)輸（Baldi et al 1994; Culbertson 2010）。在SF的球蛋白成員中含有1個(gè)基因（hemoglobin）在轉(zhuǎn)錄水平與蛋白水平上均顯著上調(diào)和3個(gè)基因（Cygb2、Ferh和ferritin heavy chain）在轉(zhuǎn)錄后水平上顯著上調(diào)。血紅蛋白（hemoglobin）是最重要的球蛋白之一，在氧氣運(yùn)輸中起著關(guān)鍵作用。無脊椎動(dòng)物在大多數(shù)情況下血紅蛋白的濃度較低，但是缺氧會(huì)導(dǎo)致淡水浮游動(dòng)物生物體內(nèi)的血紅蛋白濃度顯著增加，這表明血紅蛋白合成的誘導(dǎo)可以提高水蚤對(duì)低環(huán)境溶解氧水平的耐受性，并使生物體在這種壓力下生存（Pirow et al 2001）。鑒于在枝角類有性生殖發(fā)生的環(huán)境溶氧水平相對(duì)較低，進(jìn)一步證明溶解氧水平可能是枝角類發(fā)生生殖轉(zhuǎn)化的重要環(huán)境因素。與hemoglobin相似，蛋白組數(shù)據(jù)中存在的Cygb2也屬于球蛋白家族，其在SF中顯著上調(diào)。由于先前的研究已經(jīng)證明Cygb2可以在缺氧條件下上調(diào)并在需氧反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用（Fago et al 2004; Schmidt et al 2004），所以推測(cè)Cygb2也可能參與微型裸腹溞的細(xì)胞內(nèi)氧氣儲(chǔ)存或轉(zhuǎn)運(yùn)。除hemoglobin和Cygb2外，F(xiàn)erh和ferritin heavy chain也在三價(jià)鐵的結(jié)合和運(yùn)輸中起重要作用，Larade和Storey）報(bào)道，鐵蛋白的濃度可在缺氧等應(yīng)激條件下迅速升高（Larade and Storey 2004），這意味著鐵蛋白是缺氧的急性期蛋白（Beck et al 2002）。眾所周知，環(huán)境信號(hào)可以調(diào)節(jié)動(dòng)物的各種關(guān)鍵生理過程，參與氧氣運(yùn)輸?shù)那虻鞍紫嚓P(guān)基因均在SF中上調(diào)以響應(yīng)缺氧條件,這表明低氧含量可能導(dǎo)致微型裸腹溞發(fā)生生殖轉(zhuǎn)化。另一方面，SF中球蛋白相關(guān)基因的高表達(dá)水平也可能表明SF需要更多的氧氣來完成有性生殖并產(chǎn)生休眠卵。

2）卵黃原蛋白相關(guān)基因

Vitellogenin（Vg/Vit-2）vitellogenin-2（Vg2）都是卵黃原蛋白（Vg）家族的成員，其在枝角類卵黃蛋白的形成中起關(guān)鍵作用（Kato et al 2004）。卵黃原蛋白是卵黃蛋白（vitellin，Vn）的主要前體，為卵生生物的胚胎發(fā)育提供能量（Matozzo et al 2008）。在SF與PF的比較中，SF中的Vg和vitellogenin-2的表達(dá)水平均顯著高于PF，在中華擬同形溞中也報(bào)道了類似的結(jié)果（Zhang et al 2016）。此外，還發(fā)現(xiàn)SF中Dmagvtg1在轉(zhuǎn)錄后水平顯著上調(diào)，先前的研究已經(jīng)報(bào)道Dmagvtg1編碼Vg，Vg的前體是大型溞卵中最豐富的多肽（Kato et al 2004）。這些結(jié)果表明SF可產(chǎn)生更多卵黃蛋白包裹入休眠卵中以促進(jìn)胚胎發(fā)育。與Vg類似，F40A3.3也在SF中高表達(dá)，其功能注釋為脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)或脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性，并且在脂質(zhì)結(jié)合中起重要作用。因此，它也可能參與SF中卵黃蛋白的合成。

3）表皮相關(guān)基因

與PF相比有7個(gè)基因及其蛋白質(zhì)產(chǎn)物（cuticle protein 6、cuticle protein 7、endocuticle structural glycoprotein SgAbd-2、endocuticle structural glycoprotein Sgabd-8、Pcp20、Pcp27和Cyp301a1）在SF中顯著上調(diào)，它們與表皮或幾丁質(zhì)的合成有關(guān)。在這些基因中，與PF相比，cuticle protein 7、endocuticle structural glycoprotein SgAbd-2、Pcp20和Cyp301a1在SF轉(zhuǎn)錄后水平的表達(dá)水平顯著更高。表皮蛋白和幾丁質(zhì)都參與表皮的形成，表皮是昆蟲抵抗環(huán)境脅迫的最重要屏障（Neville et al 1976）。在枝角類中，表皮也由表皮蛋白和幾丁質(zhì)組成，它們可以抵抗外部不利的環(huán)境條件（Repka et al 1995; Liu et al 2014b）。最近的一項(xiàng)研究表明，大型溞可以在蘇格蘭小蝦的存在下產(chǎn)生一系列的形態(tài)變化，包括甲殼形態(tài)變化和表皮硬化（Otte et al 2014）。此外，另一項(xiàng)研究表明Cyp301a1參與黑腹果蠅成蟲表皮的形成（Sztal et al 2012）?？偟膩碇v，表皮相關(guān)基因和蛋白質(zhì)的高表達(dá)表明這些其可以幫助SF在表皮結(jié)構(gòu)中發(fā)生一系列相應(yīng)的變化以應(yīng)對(duì)不利的外部環(huán)境條件。另外，SF需要產(chǎn)生休眠卵以度過不利的環(huán)境條件，并且休眠卵由具有厚表皮的黑色卵鞍包裹，這些結(jié)果表明在SF中上調(diào)的表皮相關(guān)基因也可能在卵鞍的形成中起關(guān)鍵作用。

4）熱休克蛋白（HSP）相關(guān)基因

與PF相比，3個(gè)熱休克蛋白（Hsp）相關(guān)家族（Hsp-16.2、ECU02_0100和Cryaa）的成員在SF中高表達(dá)。Hsp-16.2編碼一種小的熱休克蛋白（sHsp），其在保護(hù)蛋白質(zhì)免受應(yīng)激誘導(dǎo)的聚集中起重要作用（Pozsgai et al 2007）。先前的研究已經(jīng)證明Hsp16.2的抗細(xì)胞凋亡作用是由Hsp90的活化介導(dǎo)的，即Hsp16.2與Hsp90相結(jié)合（Bellyei et al 2007a）。此外，Hsp16.2的過表達(dá)可以增加脂筏的形成，從而有助于穩(wěn)定質(zhì)膜（Bellyei et al 2007a,b）。ECU02_0100是一種Hsp70相關(guān)蛋白，屬于Hsp70s家族成員。Hsp70s在應(yīng)激耐受性和逆境生存中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用（Mikulski et al 2011），它們還可以促進(jìn)新合成蛋白質(zhì)的正確折疊（Mayer and Bukau 2005）。Cryaa可編碼α-晶狀體蛋白A鏈（αAC），其屬于α-晶狀體蛋白（αC）。與Hsp16.2類似，αC與sHSP家族C末端的90-100個(gè)殘基的氨基酸序列具有明顯的序列同源性（Klemenz et al 1991）。在熱應(yīng)激和氧化應(yīng)激下αC的表達(dá)顯著增加，這表明αC也是響應(yīng)于多種環(huán)境脅迫的分子伴侶（類似于sHSP）?？偟膩碚f，這些發(fā)現(xiàn)表明SF中3個(gè)Hsp基因的高表達(dá)可以通過維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)來保護(hù)微型裸腹溞免受各種環(huán)境應(yīng)激刺激（如低溫或高溫，缺氧）。此外，這些發(fā)現(xiàn)還表明Hsp蛋白可能是處理環(huán)境壓力和維持體內(nèi)平衡的關(guān)鍵蛋白，其在成功發(fā)生生殖轉(zhuǎn)化中起重要作用。

5）甲基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因

甲基轉(zhuǎn)移酶是一大類酶，包括蛋白質(zhì)甲基轉(zhuǎn)移酶、DNA/RNA甲基轉(zhuǎn)移酶、天然產(chǎn)物甲基轉(zhuǎn)移酶和非S-腺苷甲硫氨酸（SAM）依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶。對(duì)于蛋白質(zhì)甲基轉(zhuǎn)移酶，先前的研究已經(jīng)證明法呢酸O-甲基轉(zhuǎn)移酶（farnesoic acid O-methyltransferase）是十足類和鰓足類甲殼類動(dòng)物合成甲基法尼酯的主要貢獻(xiàn)酶（Ruddell et al 2003; Li et al 2010）。最近的研究報(bào)道甲基法尼酯在調(diào)節(jié)水蚤生殖轉(zhuǎn)化方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用（LeBlanc and Medlock 2015）。這些研究結(jié)果表明在SF中編碼甲基轉(zhuǎn)移酶的上調(diào)基因（Mettl10和Ndufaf5）也可能與微型裸腹溞的生殖轉(zhuǎn)化有關(guān)，另一方面DNA甲基轉(zhuǎn)移酶可以催化甲基轉(zhuǎn)移到DNA，DNA甲基化是遺傳調(diào)控的關(guān)鍵組成部分，主要發(fā)生在堿性胞嘧啶的5-C上，形成50個(gè)甲基胞嘧啶，并且不會(huì)引起DNA序列的變化（Lan et al 2010）。已經(jīng)在大型溞中檢測(cè)到DNA甲基化的存在，這表明該物種可能發(fā)生著潛在的表觀遺傳效應(yīng)（Vandegehuchte et al 2009）。與PF相比，Mettl10和Ndufaf5基因產(chǎn)物在SF中的高表達(dá)表明DNA甲基化也可能與微型裸腹溞的生殖轉(zhuǎn)化有關(guān)。

6）編碼肽酶、過氧化物酶和脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的基因

與PF相比，iTRAQ結(jié)果顯示一些編碼肽酶、過氧化物酶和脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的基因在SF中高表達(dá)。在幼蟲蛻皮期間，組織蛋白酶L樣蛋白酶（Cathepsin L-like proteinase）在棉鈴蟲中上調(diào)表達(dá)（Wang et al 2010）。絨毛膜過氧化物酶（Chorion peroxidase）參與埃及伊蚊的不溶性卵絨毛膜的形成（Li et al 1996）。所以推測(cè)組織蛋白酶L樣蛋白酶和絨毛膜過氧化物酶可能參與微型裸腹溞在不利條件下胚胎和幼體的發(fā)育過程。載脂蛋白D（Apolipoprotein D）是一種具有保護(hù)作用的急性反應(yīng)蛋白，參與調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激保護(hù)的機(jī)制（Ganfornina et al 2008）。與PF相比，載脂蛋白D在SF中也顯著上調(diào)，這可能有助于保護(hù)微型裸腹溞免受氧化應(yīng)激的危害。這些研究結(jié)果表明在SF中上調(diào)的組織蛋白酶L樣蛋白酶、絨毛膜過氧化物酶和載脂蛋白D可能在微型裸腹的生殖轉(zhuǎn)化中發(fā)揮作用。

2.5 小結(jié)

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)的分析，確定了微型裸腹溞中涉及生殖轉(zhuǎn)化的幾個(gè)關(guān)鍵DEGs和DEPs。結(jié)果表明轉(zhuǎn)錄后調(diào)控可能在生殖轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用。在SF中上調(diào)的基因及其蛋白產(chǎn)物主要屬于球蛋白相關(guān)家族、卵黃原蛋白相關(guān)家族、表皮相關(guān)家族、熱休克蛋白相關(guān)家族和甲基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)家族，表明這些基因可能在微型裸腹溞的生殖轉(zhuǎn)化中起關(guān)鍵作用。與之相反，GO分析表明PF中上調(diào)的基因與代謝過程密切相關(guān)，這可能是PF群體能夠快速增殖的原因。綜合轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)為探究微型裸腹溞生殖轉(zhuǎn)化中的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控提供了新的見解和寶貴的資源。此外，該研究還提供了許多可用于進(jìn)一步進(jìn)行功能研究的與微型裸腹溞生殖轉(zhuǎn)換相關(guān)的關(guān)鍵候選基因及其蛋白產(chǎn)物。