第三章 隆線溞不同生殖個體間RNA-seq與miRNA-seq分析

3.1 前言

隆線溞（Daphnia carinata）隸屬節(jié)肢動物門（Arthropoda）、甲殼綱（Crustacea）、鰓足亞綱（Branchiopoda）、雙甲目（Diplostraca）、枝角亞目（Cladocera）、溞科（Daphniidae），是魚類的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)來源（Yang 1994）。隆線溞生命周期短，易于在實驗室進行培養(yǎng)，擁有獨特的生活史，涉及周期性孤雌生殖，隨著變化的環(huán)境條件轉(zhuǎn)變生殖模式（Harris et al 2012），可被用作枝角類生殖學研究的重要模型。

當環(huán)境條件適宜時，雌性通常以孤雌生殖方式進行繁殖，惡劣的環(huán)境條件，如食物缺乏、低溫或高溫和高種群密度，會誘導(dǎo)雄性的產(chǎn)生，生殖方式由孤雌生殖轉(zhuǎn)變?yōu)橛行陨常℅ordo et al 1994; Cao et al 2001）。這種生殖轉(zhuǎn)化的繁殖策略有利于枝角類快速適應(yīng)不同的環(huán)境條件，有助于維持其種群的活力（Toyota et al 2016）。因此，隆線溞也是一種用于闡明枝角類性別決定和生殖轉(zhuǎn)化分子基礎(chǔ)的重要的模式生物。盡管如此，關(guān)于隆線溞的生殖轉(zhuǎn)化的詳細機制知之甚少。

環(huán)境因子變化對隆線溞生殖的影響的研究較少（Leung 2009）。Dinh等研究了食物的質(zhì)量與數(shù)量、光照強度和培養(yǎng)體積對隆線溞休眠卵產(chǎn)生的影響，結(jié)果表明，在中等光強條件下飼喂柵藻可以誘導(dǎo)其進行有性生殖；食物限制并不是其從孤雌生殖轉(zhuǎn)向有性生殖的必然要求；培養(yǎng)體積可能是其進行有性生殖的重要決定因素（Dinh et al 2018）。陸開宏等研究表明高溫或大幅變溫、高密度和半饑餓狀態(tài)條件下皆能明顯誘發(fā)隆線溞冬卵的形成（陸開宏等1992）。

在分子調(diào)控層面，張明鳳等提取了隆線溞孤雌溞和兩性雌溞的可溶性蛋白進行雙向電泳和質(zhì)譜鑒定，發(fā)現(xiàn)一類酸性脫氫酶（21234）可能在隆線溞的生殖轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用（張明鳳等2006）。徐曉倩和秦芬在構(gòu)建隆線溞孤雌溞和有性雌溞的cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)在不同生殖體中存在一些高表達的基因（徐曉倩2009；秦芬2009）。此外，隆線溞生殖轉(zhuǎn)化相關(guān)基因及其對性別分化的影響已在多項研究中得到闡述，如DapcaDsx1（Zhang et al 2014）、cuticular protein (CP)（Liu et al 2014b）、DcarTra（Kong et al 2015）、DcarChk1（Kong et al 2016）和Chemosensory proteins (DacaCSP2和DacaCSP3)（Li et al 2016）等。由于枝角類生殖轉(zhuǎn)換過程的復(fù)雜性，上述的研究并未真正確定枝角類的生殖轉(zhuǎn)換機制。

近年來，第二代測序技術(shù)的進步促使了許多關(guān)于miRNAs的研究。miRNAs是一類獨特的短（18-25 nt）非蛋白編碼內(nèi)源RNA，參與各種細胞過程（Bartel 2004）。作為關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，miRNAs主要通過抑制靶基因表達來調(diào)節(jié)基因表達（Guo et al 2005）。假設(shè)一些miRNAs在隆線溞等枝角類的生殖轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)錄重組過程中起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用，但是關(guān)于隆線溞miRNAs的信息很少。為了更好地探索miRNAs對隆線溞生殖轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)作用以及獲得重要見解，一個miRNAs和mRNA轉(zhuǎn)錄組的整合分析是必需的。

為了研究miRNA/mRNA調(diào)控在生殖轉(zhuǎn)化中的潛在作用，本研究在隆線溞的有性生殖雌體（SF）、孤雌生殖雌體（PF）和雄性（M）中進行了miRNA和mRNA轉(zhuǎn)錄表達譜分析。據(jù)調(diào)查，這是第一次整合miRNA和mRNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析研究以支持miRNA介導(dǎo)的不同生殖個體在生殖轉(zhuǎn)換中基因表達的調(diào)控。為進一步研究枝角類復(fù)雜生殖轉(zhuǎn)化階段的分子基礎(chǔ)和性別分化奠定了基礎(chǔ)?？傊?，隆線溞轉(zhuǎn)錄組和miRNA數(shù)據(jù)集為生殖轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的研究提供了寶貴的資源。

3.2 材料與方法

3.2.1 枝角類培養(yǎng)系統(tǒng)的構(gòu)建及動物材料收集

構(gòu)建了一種半自動化實驗室枝角類高量擴增的系統(tǒng)，包括貨架、溫控系統(tǒng)、充氧系統(tǒng)、光控系統(tǒng)、培養(yǎng)系統(tǒng)以及餌料投喂系統(tǒng)。貨架呈層式結(jié)構(gòu)，通過隔板分隔為六個獨立的空間單元；培養(yǎng)系統(tǒng)包括培養(yǎng)容器，培養(yǎng)容器放置在貨架上的各個空間單元內(nèi)；充氧系統(tǒng)包括靜音氣泵、氣流管道、氣流緩沖裝置以及獨立閥門（圖3-1）。該系統(tǒng)可使枝角類養(yǎng)殖實現(xiàn)條件可控、穩(wěn)質(zhì)高產(chǎn)、實驗室規(guī)模化生產(chǎn)。

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隆線溞是從南湖（中國，武漢）分離出來的，建立純系培養(yǎng)了2年。隆線溞的培養(yǎng)在上述的高效培養(yǎng)系統(tǒng)中進行，培養(yǎng)溫度控制在25±2℃，光周期設(shè)定為光：暗=16 h：8 h，并喂食斜生柵藻。根據(jù)隆線溞的生物學特性，當種群密度達到一定水平時就會發(fā)生生殖殖轉(zhuǎn)化。使用OLYMPUS BA200顯微鏡分別收集并鑒定健康有活力的SF、PF和M（圖3-2），放入凍存管中（100只/瓶）。然后將凍存管中的隆線溞用無菌ddH2O洗滌2-3次并將水吸干，在液氮中快速冷凍，然后儲存在-80℃。在進行測序時，轉(zhuǎn)錄組測序使用3個生物學重復(fù)，小RNA測序使用2個生物學重復(fù)。

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3.2.2 主要儀器與試劑

1)主要儀器：梯度PCR儀L96G（杭州朗基科學儀器有限公司），微量移液器（Eppendorf），凝膠成像分析系統(tǒng)（Syngene），DYY-III型電泳儀及水平電泳槽（北京六一儀器廠），臺式低溫高速冷凍離心機（Eppendorf），超凈工作臺（江蘇蘇凈集團有限公司），恒溫水浴鍋（北京六一儀器廠），GZX-III系列光照培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司），組織研磨器TissueLyser II（QIAGEN），實時熒光定量PCR儀（ThermoFisher Scientific），NanoDrop 2000分光光度計（賽默飛）等。

2)主要試劑：PCR反應(yīng)試劑（rTaq酶，dNTP等）（Takara），Trizol（上海翊圣生物科技有限公司），DL2000 DNA Marker（Takara公司），RNA 6000 Nano kit (Agilent Technologyies, Santa Clara, CA），TruSeq RNA sample prep Kit (San Diego, CA, USA)，Truseq^TM Small RNA sample prep Kit (San Diego, CA, USA)，PrimeScript RT reagent kit (Takara)，One Step Prime-Script miRNA cDNA Synthesis Kit (Takara)，Hieff qPCR SYBR? Green Master Mix（上海翊圣生物科技有限公司）等。

3.2.3 mRNA-seq、小RNA文庫構(gòu)建和Illumina測序

使用TRIzol試劑從每種動物材料中提取總RNA。使用Nanodrop 2000分光光度計評估樣品純度和RNA濃度，并使用RNA 6000 Nano kit（Agilent Technologyies, Santa Clara, CA）在Agilent 2100生物分析儀上分析RNA的質(zhì)量。對于mRNA-seq，cDNA文庫構(gòu)建和測序在Majorbio Biotech Co., Ltd.（中國上海）進行。簡言之，用來自總RNA的磁性O(shè)ligo-dT珠（Invitrogen, USA）分離poly(A)+ mRNA，然后使用來自Illumina的TruSeq RNA sample prep Kit（San Diego, CA, USA）根據(jù)Illumina協(xié)議構(gòu)建文庫，使用Illumina HiSeq^TM 2000系統(tǒng)（Illumina Inc.）進行測序。為了得到小RNA文庫，使用Truseq^TM Small RNA sample prep Kit（San Diego, CA, USA）將來自每種材料的總量為1μg的總RNA作為輸入材料來構(gòu)建小RNA文庫。隨后，在Illumina HiSeq^TM 2000系統(tǒng)上進行SE50測序。

3.2.4 mRNA分析

將mRNA測序得到的raw data 進行質(zhì)控后，使用Trinity程序以默認設(shè)置de novo組裝成更長且無間隙的contigs（Grabherr et al 2011）。然后使用BLASTX與NR、Swiss-Prot、COG和KEGG數(shù)據(jù)庫進行比對來注釋由mRNA reads組裝產(chǎn)生的unigenes，E-value截斷值設(shè)置為1e-5（Camacho et al 2009, Grabherr et al 2011）。使用Blast2GO軟件（Conesa et al 2005）分析GO的功能注釋，并使用WEGO軟件對unigenes進行GO功能分類（Ye et al 2006）?；虮磉_量的計算方法使用FPKM（Li and Dewey 2011）。使用edgeR確定SF、PF和M之間基因表達差異的顯著性（Robinson et al 2010）。將|log2FC|≥1且P-value<0.05作為基因表達顯著差異的閾值。使用Goatools（或KOBAS）軟件對差異表達的基因（DEGs）進行GO或KEGG pathway富集分析。將校正的（Bonferroni）P-value≤0.05分別作為GO條目或pathways顯著富集的閾值。

3.2.5 小RNA分析

對原始測序reads質(zhì)控后篩選出clean reads，然后，將高質(zhì)量的sRNAs reads映射到Rfam（版本12.1）數(shù)據(jù)庫，以丟棄rRNA-、snRNA-、scRNA-、snoRNA-、tRNA-和核酶相關(guān)的reads（Nawrocki et al 2015）。使用BLASTN搜索針對所有已知的Daphnia miRNA前體和成熟序列（miRBase 21）來鑒定和注釋保守的miRNAs，不超過一個錯配（Kozomara and Griffithsjones 2014）。然后，使用miRDeep2鑒定新的成熟miRNAs（Friedl?nder et al 2012）。隨后，使用RNAfold軟件預(yù)測它們的發(fā)夾二級結(jié)構(gòu)（Hofacker et al 1994），并且基于序列相似性將鑒定的miRNAs以家族分組。將miRNAs的read counts歸一化為TPM。使用edgeR鑒定SF、SP和M之間的差異表達的miRNAs（DEMs）（Robinson et al 2010）。將|log2FC|≥1且P-value<0.05設(shè)置為miRNAs顯著差異表達的閾值。使用miRanda軟件預(yù)測已知miRNAs和新miRNAs的潛在靶基因（Enright et al 2003），并且從mRNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析中鑒定的DEGs列表中獲取miRNAs靶基因的表達水平。通過將DEMs的靶基因定位于GO條目和KEGG pathways進行GO和KEGG分析。如前面部分所述，使用已用于DEGs的類似方法進行miRNA靶基因的GO富集和pathway富集分析。

3.2.6 mRNA和miRNAs表達譜的整合分析

使用DEGs和DEMs靶基因構(gòu)建了差異基因庫和miRNA靶基因庫，然后在兩個基因庫中進行相關(guān)分析，并選擇在表達水平上與miRNA相關(guān)的差異靶基因。隨后，利用miRNAs與靶基因的調(diào)控關(guān)系，對miRNAs及其靶基因進行整合網(wǎng)絡(luò)分析，分析關(guān)鍵的miRNA-mRNA對，篩選出所有相關(guān)的miRNA-mRNA對。使用Cytoscape軟件對miRNA-靶基因?qū)M行網(wǎng)絡(luò)可視化分析（Shannon et al 2003）。

3.2.7 RT-qPCR驗證

使用TRIzol試劑分別從SF、PF和M樣品中提取總RNA，使用Nanodrop 2000分光光度計評估樣品純度和RNA濃度。使用PrimeScript RT reagent kit (Takara)分別將SF、PF和M的10μg總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄。為了測定miRNA的表達，使用One Step Prime-Script miRNA cDNA Synthesis Kit (TaKaRa)將SF、PF和M的10μg總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，其在miRNA的3'末端添加ploy(A)尾，并且利用已知的oligo-dT連接物引導(dǎo)進行轉(zhuǎn)錄。使用針對DEGs或DEMs的特異性引物在ABI 7500 real-time PCR系統(tǒng)上（Applied Biosystems, United States）對獲得的RT樣品進行qPCR。引物序列和反應(yīng)體系見表3-1和表3-2，采用三步法對mRNA進行RT-qPCR，具體如下：預(yù)變性95℃ 10 min，接著36個循環(huán)包括變性95℃ 15 sec，64℃退火30 sec及72℃延伸30 sec；采用兩步法miRNA進行RT-qPCR，具體如下：預(yù)變性95℃ 5 min，接著40個循環(huán)包括變性95℃ 15 sec，64℃退火45 sec。在基因表達量分析中，使用QuantStudioReal-Time PCR 軟件和2^-ΔΔCt方法分析目的基因的相對表達量（Livak and Schmittgen 2001）。為了準確評估SF、PF和M中基因和miRNA的表達水平，將GAPDH和dpu-miR-276（在各樣本組織中表達量相同）分別用作mRNA和miRNA的內(nèi)參對照。

3.3 結(jié)果

3.3.1 轉(zhuǎn)錄組測序、注釋和比較分析

對隆線溞SF、PF和M構(gòu)建的3個cDNA文庫在Illumina HiSeq 2000測序后，分別從SF、PF和M文庫獲得530,415,70、476,790,98和453,596,98條clean reads，并且所有Q30均高于92％。然后，將clean reads合并在一起并de novo組裝成25,428個unigenes，平均長度為1355 bp，N50長度為2746 bp。然后將所有unigenes通過Blastx比對到NR、Pfam、String、Swiss-Prot、GO和KEGG數(shù)據(jù)庫進行注釋。使用FPKM分析比較這些文庫來研究SF、PF和M中unigenes的表達水平，以P-value<0.05和|loglog2FC|≥1作為顯著差異表達的閾值條件?？偣灿?127（657個基因在SF中上調(diào)，470個基因在SF中下調(diào)）、1616（914個基因在M中上調(diào)，702個基因在M中下調(diào)）和738（405個基因在M中上調(diào)，333個基因在M中下調(diào)）個基因分別在SF vs. PF、M vs. SF和M vs. PF中顯著差異表達。

為了更好地了解生殖轉(zhuǎn)化中涉及的生物過程，我們分別分析了三組DEGs在兩兩比較中GO富集和pathway富集的豐度差異（SF vs. PF、M vs. SF和M vs. PF）。

GO條目富集分析表明：1）SF vs. PF：SF中富集的類別包括結(jié)構(gòu)分子活性、表皮相關(guān)（如表皮和幾丁質(zhì)結(jié)合的結(jié)構(gòu)成分）、氧化應(yīng)激相關(guān)（如氧化還原酶活性和氧化還原過程）和血紅蛋白相關(guān)（如四吡咯結(jié)合、血紅素結(jié)合和鐵離子穩(wěn)態(tài)）；PF中富集的GO條目與DNA包裝（如核酸結(jié)合和DNA結(jié)合）、轉(zhuǎn)錄（如轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)和基因表達的調(diào)節(jié)）和代謝過程廣泛相關(guān)（圖3-3）。2）M vs. SF：M中主要富集的GO條目包括結(jié)構(gòu)分子活性（如核糖體的結(jié)構(gòu)成分）、轉(zhuǎn)移酶活性、肽代謝過程（如翻譯和肽生物合成過程）、糖基化和表皮的結(jié)構(gòu)成分；SF中富集的GO類別包括氧化應(yīng)激相關(guān)（如氧化還原酶活性和氧化還原過程）、角質(zhì)層的結(jié)構(gòu)成分、超氧化物代謝過程和激酶活性（圖3-4）。3）M vs. PF：M相關(guān)基因顯著富集的GO類別涉及結(jié)構(gòu)分子活性、信號傳導(dǎo)受體活性（如跨膜信號受體活性和G蛋白偶聯(lián)受體活性）和刺激過程（特別是光刺激過程相關(guān)的光轉(zhuǎn)導(dǎo)、檢測、視覺感知和感官知覺）；PF相關(guān)基因大多數(shù)富集于轉(zhuǎn)運活性、細胞周期調(diào)節(jié)和激酶相關(guān)功能，如底物特異性轉(zhuǎn)運蛋白活性、細胞周期蛋白和蛋白激酶活性的調(diào)節(jié)（圖3-5）。

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KEGG通路富集分析：1）SF vs. PF：在SF和PF中代表性的通路分別是溶酶體和各種類型的N-聚糖生物合成，此外它們都富集于蛋白質(zhì)消化與吸收以及ECM-受體相互作用（圖3-6）。2）M vs. SF：M相關(guān)基因主要聚集在核糖體和各種類型的N-聚糖生物合成的通路中，而在SF中顯著富集的通路是溶酶體、過氧化物酶體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工（圖3-7）。3）M vs. PF：核糖體、各種類型的N-聚糖生物合成和糖鞘脂生物合成的通路在M中顯著富集，而對于PF相關(guān)基因，它們主要富集在蛋白質(zhì)消化吸收、細胞周期和神經(jīng)活性配體-受體相互作用的通路（圖3-8）。有趣的是，在上述三組通路富集分析中，各種類型的N-聚糖生物合成通路在任何一組中均顯著富集。

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此外，從前12個通路中選出了幾個值得注意的與環(huán)境信息處理和代謝相關(guān)的類別，如與PF相比，在SF中上調(diào)的ECM受體相互作用通路、PI3K-Akt信號通路和谷胱甘肽代謝通路；與SF相比，在M中上調(diào)的鞘糖脂生物合成通路、糖胺聚糖生物合成通路和神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路；與PF相比，在M中上調(diào)的鞘糖脂生物合成通路、糖胺聚糖生物合成通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路、光轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和AMPK信號傳導(dǎo)通路（表3-3）。這些結(jié)果可以作為三個不同生殖個體中發(fā)生顯著不同的生物過程的指示，為進一步研究確定其在生殖轉(zhuǎn)化中的功能提供有價值的信息。

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3.3.2 與生殖轉(zhuǎn)化相關(guān)的DEGs

重點關(guān)注SF、PF和M之間生殖相關(guān)基因的變化以揭示與生殖轉(zhuǎn)化相關(guān)的候選基因。因此，在GO/pathway富集分析和參考注釋的基礎(chǔ)上，1）SF vs. PF：與PF相比較，在SF中鑒定出了42個上調(diào)（表3-4）和37個下調(diào)（表3-5）的與生殖相關(guān)的基因，如上調(diào)的膠原蛋白家族基因（COL4A3、Col1a1、COL1A1等）、氧化還原相關(guān)基因（CYP4C1、Cyp4c3、Cyp18a1等）、chitin_bind_4-家族基因（Lcp5、Lcp17、Lcp22等）、氧氣運輸相關(guān)基因（FCP、CAB1、Dhb1等）、HSP類（l(2)efl和HSP82）和下調(diào)的胚胎發(fā)育相關(guān)基因（Chst11和sp8b）、homeobox家族基因（B-H2、Gsc、hoxa1a等）、轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因（C1GalTA、Pomt1、Pomt2等）；2）M vs. SF：與SF相比較，在M中發(fā)現(xiàn)40個上調(diào)（表3-6）和41個下調(diào)（表3-7）與生殖相關(guān)的基因，如上調(diào)的細胞外基質(zhì)相關(guān)基因（PXDN、MUC5AC、Col1a1等）、雄性性別決定基因（dmrt1）、核糖體家族（Rpl18、Rpl4、Rpl5等）、胰蛋白酶家族基因（Klkb1、Prss27、Trypsin 1和Trypsin 2等）、轉(zhuǎn)移酶樣類別基因（B4galt1、B4galt6、B3galt4等）和下調(diào)的氧化還原基因（SOD1、SOD2、SODCC等）、細胞色素P450家族基因（CYP4C1、CYP4C1等）、cyclin_N家族基因（ccnb2、CYCA1-4等）、Chitin_bind_4-家族基因（PCP20、CP19.8、CP10.9等）、HSP類基因（HSP70、l(2)efl等）；3）M vs. PF：與PF相比較，在M中鑒定出了23個上調(diào)（表3-8）和37個下調(diào)（表3-9）與生殖相關(guān)的基因，如上調(diào)的細胞外基質(zhì)相關(guān)基因（PXDN、COL1A2和Sgs3）、7tm_1家族基因（Cckar、CEO1、CEO2等）、galactosyl_T-家族基因（B3GNT2、B3GNT3和B3GNT7）和下調(diào)的膠原蛋白家族基因（COL4A5、Col9a1）、胰蛋白酶家族基因（TRY4B、HA）、蛋白結(jié)合相關(guān)基因（Pclo、Twist1、His3、Prmt8等）、cyclin_N-家族基因（ccnb2、CycE等）和轉(zhuǎn)運蛋白相關(guān)基因（AMT1-3、abcG23、Tret1等）。這些與生殖轉(zhuǎn)化相關(guān)的基因資源有助于對隆線溞生殖調(diào)節(jié)有更好地理解。

3.3.3 miRNA表達譜

miRNA是一類短的非編碼內(nèi)源RNA，在各種生物和代謝過程中發(fā)揮重要作用。盡管過去幾年已經(jīng)對miRNA進行了長期研究，但對于隆線溞中的miRNA卻知之甚少。為了深入探究miRNA在隆線溞生殖轉(zhuǎn)化過程中的作用，分別對SF、PF和M構(gòu)建了3個小RNA文庫。測序和質(zhì)控后，分別獲得來自SF的94,663,25條clean reads，來自PF的78,177,44條clean reads和來自M的70,208,01條clean reads，長度為18~32個核苷酸，最具代表的長度為25-26 nt。通過Rfam數(shù)據(jù)庫注釋分析將rRNA、tRNA、snRNA、核酶等去除，分別來自SF、PF和M的大約1％、1.12％和1.19％的unique reads被注釋為miRNA。

為了鑒定隆線溞中的保守miRNAs，將來自3個文庫的數(shù)據(jù)與miRBase 21.0中已知的miRNAs進行比較。與已知miRNA具有同源序列的miRNA被分類為保守的miRNAs，總共獲得39個保守的miRNAs，類屬31個已知的miRNAs家族。除了保守的miRNA，還在隆線溞中鑒定出8個新的miRNAs，但未獲得它們miRNA家族信息。在保守的miRNAs家族中發(fā)現(xiàn)bantam、mir-iab-4、miR-7、miR-124和miR-252家族成員可能在隆線溞生殖轉(zhuǎn)化期間起著重要作用。隨后，分別比較SF & PF、M & SF和M & PF之間的標準化miRNA表達水平以鑒定DEMs，并將|log2FC|≥1且FDR < 0.05作為miRNA顯著差異表達的閾值。結(jié)果表明，在M vs. SF和M vs. PF中分別獲得7個DEMs（6個保守miRNA和1個新miRNA）和6個DEMs（3個保守miRNA和3個新miRNA）。有趣地是，在SF vs. PF中沒有發(fā)現(xiàn)DEMs。在M vs. SF中，4個miRNA在M中上調(diào)，而5個miRNA在M中下調(diào)；在M vs. PF中，三個miRNA在M中上調(diào)，而三個miRNA在M中下調(diào)。

4.3.4 隆線溞中DEMs的靶基因預(yù)測和功能分析

miRNAs靶基因的鑒定是進一步了解miRNAs調(diào)節(jié)功能的重要步驟。為了探究隆線溞中鑒定到的保守以及新的DEMs的生物學功能，基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行了miRNA靶標分析，共獲得了2055個相應(yīng)的靶基因。為了進一步更好地探究DEMs在生殖轉(zhuǎn)化期間靶向基因集的功能，對預(yù)測的靶標進行了前10個GO和pathway富集分析。

GO富集分析表明：1）M vs. SF：上調(diào)保守DEMs的靶基因在分子結(jié)合類和代謝過程類中高度富集；同時，下調(diào)保守DEMs的靶基因在分子結(jié)合類和蛋白質(zhì)修飾過程類中高度富集（圖3-9 A）。與保守的DEMs不同，上調(diào)的新DEMs的靶基因富集在基本的生物學過程，如細胞過程和代謝過程（圖3-9 B）。2）M vs. SF：上調(diào)保守DEMs的靶基因在結(jié)合和代謝過程類高度富集；同時，下調(diào)保守DEMs的靶基因在生物過程的調(diào)控、膜部分和結(jié)合類高度富集（圖3-10 A）。與保守的DEMs不同，上調(diào)新DEMs的靶基因主要涉及細胞成分、細胞過程和催化活性類；而下調(diào)新DEMs的靶基因主要涉及分子結(jié)合類（圖3-10 B）。

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通路富集分析表明：1）M vs. SF：保守DEMs的靶基因均廣泛分布于細胞過程中，包括粘著斑通路和肌動蛋白細胞骨架的調(diào)節(jié)通路。同時，保守上調(diào)和下調(diào)DEMs的靶基因分別在軸突導(dǎo)向通路和環(huán)境信息處理通路（ECM-受體相互作用和notch信號傳導(dǎo)途徑）中高度富集（圖3-11 A）。與保守的DEMs不同，上調(diào)的新DEMs的靶基因主要涉及mRNA監(jiān)測通路、內(nèi)吞作用通路和卵母細胞減數(shù)分裂通路（圖3-11 B）。2）M vs. PF：上調(diào)保守DEMs的靶基因與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路高度相關(guān)，包括MAPK信號通路、ras信號通路和hedgehog信號通路；而下調(diào)的保守DEMs的靶基因主要涉及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（如鈣信號傳導(dǎo)通路）和神經(jīng)系統(tǒng)通路（如膽堿能突觸和逆行內(nèi)源性大麻素信號傳導(dǎo)）（圖3-12 A）。與保守的DEMs不同，上調(diào)新DEMs的靶基因廣泛參與神經(jīng)系統(tǒng)，包括谷氨酸能突觸通路、逆行內(nèi)源性大麻素信號傳導(dǎo)通路和膽堿能神經(jīng)突觸通路，以及感覺系統(tǒng)，包括光轉(zhuǎn)導(dǎo)–fly；但是在下調(diào)的新DEMs的靶基因中沒有富集到值得注意的通路（圖3-12 B）。這些結(jié)果表明保守miRNA和新miRNA可能在生殖轉(zhuǎn)化中參與了特定的過程并發(fā)揮了特定的功能。

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3.3.5 預(yù)測的DEMs差異表達靶基因的鑒定

為了鑒定參與生殖轉(zhuǎn)化的潛在miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，構(gòu)建并可視化了差異表達miRNAs與其預(yù)測的差異表達靶基因的網(wǎng)絡(luò)圖。12個差異表達miRNAs及其預(yù)測的差異表達靶mRNA的網(wǎng)絡(luò)展示在圖3-13，14中。雖然miRNAs及其相應(yīng)靶基因具有互反表達模式，但在本研究中不僅觀察到了miRNAs與其靶基因表達水平呈負相關(guān)，而且還觀察到了與其靶基因表達水平呈正相關(guān)，包括55對正相關(guān)的miRNA-target和40對負相關(guān)的miRNA-target，如M與PF相比，novel-miR-6在M中顯著上調(diào)，其靶基因GRIK2也顯著上調(diào)；M與SF或PF相比，dpu-miR-375在M中顯著下調(diào)，而其靶基因DapmaDsx1-a也顯著上調(diào)。此外，在網(wǎng)絡(luò)圖中可以看出有2個或更多的候選調(diào)控miRNAs共享多個預(yù)測的mRNA靶基因。引人注目地是1個差異表達mRNA（Lrp2）是3個差異表達miRNA的預(yù)測靶基因，并且8個差異表達mRNA（Pxd、DAPPUDRAFT_308008、HINFP、Tgfbi、CG7218、Pclo、Wdr35和POSTEN）是2個差異表達miRNAs的預(yù)測靶基因。此外還發(fā)現(xiàn)了兩個差異表達的新miRNA（novel-miR-1和novel-miR-6）可能是關(guān)鍵的分子調(diào)控因子。這些結(jié)果證明了隆線溞生殖轉(zhuǎn)化過程中miRNA-靶基因相互作用的復(fù)雜性。

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3.3.6 候選mRNAs和miRNAs的表達驗證

為了驗證那些差異表達的mRNA和miRNA的表達模式，我們隨機選擇了24個DEGs和4個DEMs并用qRT-PCR驗證了它們的相對表達水平。結(jié)果如表3-10，11所示，表明24個mRNA和4個miRNA差異表達，表達模式與NGS數(shù)據(jù)分析相匹配，但差異表達的程度不同。

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