文章來(lái)源：Identification of Laying-Related SNP Markers in Geese Using RAD Sequencing
閱讀者：樊云鵬

摘要

產(chǎn)蛋性能是鵝生產(chǎn)的一個(gè)重要經(jīng)濟(jì)性狀。由于產(chǎn)蛋性能的遺傳力較低，因此制定一種標(biāo)記輔助選擇(MAS)策略具有重要意義。確定與目標(biāo)性狀相關(guān)的序列變異是量化MAS的前提，但目前對(duì)鵝基因組的研究較少，這嚴(yán)重阻礙了鵝產(chǎn)蛋性狀遺傳標(biāo)記的識(shí)別。最近開(kāi)發(fā)的限制性位點(diǎn)相關(guān)DNA(RAD)測(cè)序是識(shí)別大規(guī)模單核苷酸多態(tài)性(SNP)和降低基因組復(fù)雜性的一種可能方法，而不需要參考基因組信息。在本研究中，我們開(kāi)發(fā)了一種用于檢測(cè)鵝產(chǎn)蛋相關(guān)SNP的混合RAD測(cè)序策略。構(gòu)建了兩個(gè)DNA庫(kù)，每個(gè)庫(kù)由10個(gè)具有高估計(jì)育種值(HEBV)和低估計(jì)育種值(LEBV)的個(gè)體的基因組DNA組成。共從42,291,356個(gè)序列中獲得139,013個(gè)SNP，其中18,771,943個(gè)序列為L(zhǎng)EBV序列，23,519,413序列為HEBV序列。在LEBV和HEBV兩群體中，通過(guò)個(gè)體AS-PCR基因分型進(jìn)一步驗(yàn)證了在兩個(gè)DNA池中具有不同等位基因頻率的55個(gè)SNP。55個(gè)SNP中有10個(gè)在這兩個(gè)群體中表現(xiàn)出明顯的等位基因分布。這10個(gè)SNP在492只鵝群中進(jìn)一步進(jìn)行了基因分型，以驗(yàn)證其與產(chǎn)蛋量的相關(guān)性。結(jié)果表明，10個(gè)SNP中有8個(gè)與產(chǎn)蛋量有關(guān)。此外，線性回歸分析表明，SNP記錄-111407、106975和112359涉及到影響產(chǎn)蛋率的多基因網(wǎng)絡(luò)。我們使用IPCR擴(kuò)展在候選RAD標(biāo)記的兩側(cè)未知區(qū)域。對(duì)獲得的序列進(jìn)行BLAST檢索，得到鴨和雞的同源基因?？寺?個(gè)新的基因，這些基因含有候選的與產(chǎn)蛋相關(guān)的SNP，分別是膜相關(guān)鳥苷酸激酶(MAGI-1)、KIAA 1462、Rho GTPase激活蛋白21(ARHGAP 21)、酰基-CoA合成酶家族成員2(ACSF 2)、胃動(dòng)蛋白2(ASTN 2)。綜上所述，我們的數(shù)據(jù)表明，8個(gè)SNP和5個(gè)基因可能是鵝產(chǎn)量數(shù)標(biāo)記輔助選擇的候選標(biāo)記或靶點(diǎn)。

引言

鵝的繁殖力不穩(wěn)定，孵化性能差，易受遺傳、營(yíng)養(yǎng)、環(huán)境、疾病等多種因素的影響。由于生殖遺傳力較低，傳統(tǒng)的選擇方法難以改善繁殖性狀。標(biāo)記輔助選擇(MAS)是改善低遺傳力性狀的有效途徑。然而，探索性狀連鎖序列變異或功能成因需要發(fā)展MAS技術(shù)。單核苷酸多態(tài)性(SNP)是最豐富的遺傳標(biāo)記類型，它的遺傳穩(wěn)定性為研究基因組區(qū)的遺傳奠定了基礎(chǔ)。然而，目前還沒(méi)有關(guān)于鵝基因組序列的數(shù)據(jù)，這極大地阻礙了該物種在分子水平上對(duì)經(jīng)濟(jì)性狀的研究。

候選基因方法是識(shí)別與重要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的遺傳標(biāo)記的常用方法。Chen等人(2012年)在萬(wàn)江白鵝的催乳素(PRL)內(nèi)含子2中發(fā)現(xiàn)了30多個(gè)SNP，在催乳素受體(PRLR)第10外顯子中發(fā)現(xiàn)了5個(gè)SNP。這些多態(tài)性與產(chǎn)蛋率顯著相關(guān)。趙等人(2011)發(fā)現(xiàn)兩個(gè)促性腺激素釋放激素(GnRH)和PRL的SNP分別與烏龍鵝的繁殖性狀有關(guān)。Zhang等人(2013)在紫鵝的不同階段證明了黃體生成素(LH)、PRL及其受體的基因表達(dá)，丁等人(2006)用抑制消減雜交(SSH)技術(shù)鑒定了產(chǎn)蛋鵝肝臟中許多差異表達(dá)基因。這些基因包括卵黃生成素I、apoVLDL-Ⅱ、乙醇胺激酶、G蛋白γ-5亞基和白亮氨酸-tRNA合成酶。最近，郭等人(2011年)采用了類似的方法，在產(chǎn)蛋期和產(chǎn)蛋期找到了幾個(gè)差異表達(dá)的基因，包括PRLR、雌激素受體1和抗穆勒激素受體II。

新一代高通量DNA測(cè)序技術(shù)加速了研究動(dòng)物基因組研究的速度。該技術(shù)在全基因組測(cè)序、靶再測(cè)序，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中得到了廣泛的應(yīng)用。最近，Xu等人(2013)利用短讀取測(cè)序技術(shù)(Illuma)鑒定了在產(chǎn)蛋鵝和雛鵝卵巢組織中294個(gè)上調(diào)和278個(gè)下調(diào)基因的572個(gè)差異表達(dá)基因。不幸的是，由此產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄組僅提供有限的編碼區(qū)域的限制性位點(diǎn)信息，與非編碼區(qū)域相比，這些區(qū)域的核苷酸多樣性要低得多。

限制性位點(diǎn)相關(guān)DNA(RAD)測(cè)序是一種新發(fā)展起來(lái)的快速大規(guī)模SNP發(fā)現(xiàn)方法，可以有效地降低基因組的復(fù)雜性。它是一種經(jīng)濟(jì)有效的SNP發(fā)現(xiàn)和基因分型方法。它允許較小的研究小組，或研究尚未擁有參考基因組的生物體的小組，進(jìn)行“基因組范圍的研究”。RAD測(cè)序法已成功地應(yīng)用于多種生物體，其中包括：格皮、鮭魚、歐亞海貍、喉和虹鱒魚、鱘魚和菜籽。

在本研究中，我們應(yīng)用RAD測(cè)序，在鵝基因組中發(fā)現(xiàn)了新的SNP。通過(guò)比較兩個(gè)具有最低估計(jì)育種值(LEBV)和最高估計(jì)育種值(HEBV)的DNA池之間的等位基因頻率來(lái)選擇用于選擇產(chǎn)卵性能的SNP。使用等位基因特異性PCR(AS-PCR)進(jìn)行個(gè)體基因分型，首次在LEBV和HEBV群體中證實(shí)了候選SNP-連鎖模式，并在492只鵝群體中進(jìn)一步驗(yàn)證。克隆了含有與產(chǎn)蛋相關(guān)的SNP的新基因。

材料和方法

道德聲明

所有實(shí)驗(yàn)均經(jīng)南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物保護(hù)和使用委員會(huì)審核批準(zhǔn)，并按照“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例”(中國(guó)，1988年)進(jìn)行。所有的努力都是為了盡量減少采血過(guò)程中的不適。

動(dòng)物和樣品制備

本研究以江蘇麗華畜牧有限公司養(yǎng)殖場(chǎng)的492只揚(yáng)州鵝為研究對(duì)象。在試驗(yàn)過(guò)程中，鵝盡可能被喂以添加青草或水草的稻谷。這種飼料是在白天提供的，那時(shí)鵝被放生到屋外的一個(gè)空地上。在整個(gè)研究過(guò)程中，鵝暴露在自然光照和溫度下。將產(chǎn)蛋鵝分別飼養(yǎng)在不同的籠里，以記錄整個(gè)產(chǎn)蛋期的總產(chǎn)蛋量。用含液泡的肝素鈉從翼靜脈采集血樣。

產(chǎn)蛋性能與分組

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RAD文庫(kù)的制備及序列分析

使用全血DNA試劑盒(OmegaBio-TEK，Doris，USA）遵循制造商的說(shuō)明從血液中提取全基因組DNA。使用Thermo Scientific Nanodrop 2000分光光度計(jì)評(píng)估每個(gè)個(gè)體樣品的DNA濃度。所有DNA樣品的終濃度調(diào)整為100 ng/ul。A260/280和A260/230比值均在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)。每10個(gè)個(gè)體混合等量的基因組DNA準(zhǔn)備LEBV和HEBV的兩個(gè)DNA池。用限制性內(nèi)切酶EcoRI消化基因組DNA。共構(gòu)建了2個(gè)復(fù)用的測(cè)序文庫(kù)，其中每個(gè)DNA樣本被分配一個(gè)獨(dú)特的核苷酸序列標(biāo)識(shí)符 (MID)進(jìn)行條形碼編碼。用IlluminaHiSeq 2000進(jìn)行單端(101-BP)測(cè)序。

序列分析與產(chǎn)蛋相關(guān)突變檢測(cè)

從3’端將原始序列修剪到90個(gè)核苷酸，保證了97.5%以上核苷酸的質(zhì)量值在Q30以上(等于0.1%的測(cè)序誤差)。通過(guò)序列相似性，利用USTACKS為每個(gè)RAD位點(diǎn)產(chǎn)生獨(dú)特的候選等位基因，將修整后的讀數(shù)聚類成讀取標(biāo)簽（以下簡(jiǎn)稱RAD-標(biāo)簽）。對(duì)于自然種群，在該步驟中允許兩個(gè)最大堿基對(duì)錯(cuò)配。然后，使用RAD-標(biāo)簽在SNP調(diào)用的默認(rèn)參數(shù)下，使用Ustack將其折疊到集群中。對(duì)每個(gè)SNP，LEBV和HEBV池的等位基因頻率差異進(jìn)行比較。選擇兩個(gè)池間等位基因分布顯著不同的SNP作為群體進(jìn)一步驗(yàn)證的候選位點(diǎn)。

鵝群體產(chǎn)蛋相關(guān)突變的驗(yàn)證

在LEBV和HEBV組中，共選擇了55個(gè)SNP進(jìn)行進(jìn)一步的個(gè)體基因分型。不同等位基因分布的SNP在LEBV和HEBV中的分布在492只鵝的種群中進(jìn)行了驗(yàn)證。采用AS-PCR技術(shù)對(duì)群體進(jìn)行基因分型。為了提高PCR擴(kuò)增的特異性和對(duì)等位基因的可靠識(shí)別，在3’端的第三堿基處引入了一個(gè)額外的錯(cuò)配堿基對(duì)。用Primer Premier 5軟件(美國(guó)加利福尼亞州Palo Alto，Premier Bio-ft)，按照Liu和Hayashi的方法設(shè)計(jì)了AS-PCR引物。

引物和PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度在S1表中顯示。在20μL反應(yīng)中利用兩個(gè)特異性引物進(jìn)行基因分型，其中包括約50 ng模板DNA、5μL 2X PCR Taq酶(加拿大)、1μL特異引物和普通引物 (10μmol)(中國(guó)深圳)。擴(kuò)增條件為：94°C預(yù)變性3 min，32次擴(kuò)增(94℃ 30 s，45°C-72°C 30 s，72°C 30 s)，72°C擴(kuò)增5 min。用3.0%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物。

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基于產(chǎn)卵相關(guān)SNP的新基因克隆

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巢式PCR擴(kuò)增RAD標(biāo)記兩側(cè)未知序列。巢式聚合酶鏈反應(yīng)(Nest PCR)在50 ml中，50ng制備的DNA，每種引物2μ1(10μmol)和25μl LATaq酶(TAKARA，大連)。擴(kuò)增條件為：98°C預(yù)變性30 s，32次擴(kuò)增(98°C 10 s，45°C-72°C 30 s，72°C 4 min)，72°C擴(kuò)增7 min。第一輪PCR后，用雙蒸餾水稀釋PCR產(chǎn)物1：100。1微升稀釋液作為第二輪擴(kuò)增的模板。引物W(外引物對(duì))和N(內(nèi)引物對(duì))分別用于第一次和第二次PCR擴(kuò)增。在1.5% Tris/硼酸/EDTA(TBE)瓊脂糖凝膠上進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR條帶在紫外光下被去除，并按照供應(yīng)商的建議使用凝膠提取試劑盒(Omega Bio-Tek，Doraville，USA)進(jìn)行純化。根據(jù)制造商的方案，使用TA克隆試劑盒(TransgenBiotech，北京，中國(guó))將純化的DNA片段直接連接到噬菌粒TA載體(pasy-T3質(zhì)粒)中，然后轉(zhuǎn)化為感受態(tài)細(xì)胞(轉(zhuǎn)基因生物技術(shù))。在含氨芐西林50 mg/ml的LB瓊脂上進(jìn)行轉(zhuǎn)化。選擇菌落取樣，在2.0 Eppendorf管中懸浮于1ml LB培養(yǎng)基中，在37°C下生長(zhǎng)16小時(shí)。將靶DNA測(cè)序(GeneWiz，蘇州，中國(guó))。使用DNAman軟件包進(jìn)行多序列比對(duì)(版本8.0；Lynnon Bio-soft，加拿大魁北克)。使用BlastX（http://www.ncbi.nlm.nih.）進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)搜索GOV/BLAST）。.

統(tǒng)計(jì)和數(shù)據(jù)分析

采用獨(dú)立卡方檢驗(yàn)，檢測(cè)LEBV與HEBV DNA池RAD-標(biāo)記等位基因頻率的差異。對(duì)于發(fā)現(xiàn)與產(chǎn)蛋相關(guān)的SNP，用Bonferroni校正估計(jì)了5%的I類總錯(cuò)誤率的顯著性閾值，給出了

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其中α_Bon是Bonferroni調(diào)整后的P值，α是未校正的P值，n_Information是SNP的個(gè)數(shù)。Fisher’s精確檢驗(yàn)用統(tǒng)計(jì)語(yǔ)言R版本2.11.1比較LEBV和HEBV的等位基因頻率。個(gè)體的產(chǎn)蛋期估計(jì)育種值(EBV)計(jì)算如下：

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其中

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用PowerMarker V3.25計(jì)算基因型頻率、等位基因頻率、基因多樣性、雜合性、多態(tài)信息含量(PIC)和哈代-溫伯格平衡定律擬合優(yōu)度的卡方檢驗(yàn) 。所有數(shù)據(jù)均以平均±SD表示。

單因素方差分析(SPSS for Windows，20.0版；IBM-SPSS，芝加哥，IL)比較不同基因型的平均蛋數(shù)。采用Duncan的多重范圍檢驗(yàn)(SPSS for Windows，Version20.0)評(píng)估其顯著性。所有顯著性水平為p<0.05的單性狀組合均被納入進(jìn)一步的多重標(biāo)記分析。采用線性回歸方法(SPSS for Windows，20.0版)。采用線性回歸方法，分析多標(biāo)記組合和兩種數(shù)量性狀模式(加性模式：PAa(PAA P_{Aa≈(PAA + Paa)/2})/2)和顯性模式(PAa_≈P_AA或P_aa)。

結(jié)果

RAD測(cè)序

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與產(chǎn)蛋相關(guān)的SNP的發(fā)現(xiàn)

對(duì)RAD測(cè)序的138,675個(gè)SNP進(jìn)行Chisquare檢驗(yàn)，分析LEBV與HEBV池等位基因頻率的差異。經(jīng)Bonferroni調(diào)節(jié)后，467個(gè)SNP顯著(p<3.69×10^?7)。采用等位基因特異性PCR方法對(duì)所有LEBV和HEBV鵝進(jìn)行個(gè)體基因分型。用該方法可獲得55個(gè)SNP的穩(wěn)定基因型(S1表)。進(jìn)一步的個(gè)體基因分型結(jié)果表明，55個(gè)單核苷酸多態(tài)性中有10個(gè)等位基因頻率在LEBV和HEBV隊(duì)列中有顯著性差異 (p<0.00024~4.19×10^?8) (表3)。

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實(shí)驗(yàn)鵝群體產(chǎn)蛋期相關(guān)單核苷酸多態(tài)性的驗(yàn)證

通過(guò)AS-PCR對(duì)492只鵝群體進(jìn)行了基因分型 (圖1)。利用Powermark V3.25軟件對(duì)每個(gè)SNP進(jìn)行遺傳多樣性分析。如表4所示，10個(gè)SNP的基因多樣性(HE)、雜合性(H0)和多態(tài)性信息內(nèi)容(PIC)分別為0.4394-0.4991、0.0830-0.533和0.3161-0.3746。記錄135849的SNP具有最高的基因多樣性、雜合度和PIC。PIC常用作分子標(biāo)記遺傳多態(tài)性的指標(biāo)。在本研究中，10個(gè)SNP的PIC值范圍為0.25-0.5，表明這些SNP表現(xiàn)出中間水平的多態(tài)性。7個(gè)SNP顯示與Hardy-Weinberg平衡(HWE)的顯著偏離(p<0.05)，而其它三個(gè)SNP，包括記錄-135849、記錄-88247和記錄-135057均在HWE中(p>0.05)。

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如表5所示，記錄-106975的GG和GA基因型產(chǎn)蛋量顯著高于AA基因型的（p<0.01）。GG基因型與GA基因型在產(chǎn)蛋量上無(wú)顯著差異(p>0.05)。

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SNP記錄-134172具有AA基因型鵝產(chǎn)蛋量明顯高于AT基因型鵝(p<0.01)，TT基因型與AA和AT基因型無(wú)顯著性差異(p>0.05)。

記錄-112359，TT基因型的產(chǎn)蛋量顯著高于GG基因型(p<0.01)。TG基因型與TT基因型和GG基因型相比，產(chǎn)蛋量差異無(wú)顯著性(p>0.05)。

記錄-106582，AA和CA基因型的產(chǎn)蛋量顯著高于GG基因型，但CA基因型與AA基因型之間差異無(wú)顯著性(p>0.05)。

記錄-111407，AA型和TA型鵝產(chǎn)蛋量顯著高于TT型鵝(p<0.01)。AA和TA基因型的產(chǎn)蛋量差異不顯著(p>0.05)。

在記錄-88247中，AA基因型的產(chǎn)蛋量顯著高于GG基因型(p<0.01)。AA基因型產(chǎn)蛋量顯著高于GA基因型(p<0.05)。

對(duì)于記錄135057，AA和GA基因型的產(chǎn)蛋量顯著高于GG基因型(p<0.01)。

在記錄-130775中，AA和AG基因型的產(chǎn)蛋率高于GG基因型(p<0.01)。

記錄-135849和記錄-130652的基因型與產(chǎn)蛋量之間無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05)。結(jié)果表明，這8個(gè)單核苷酸多態(tài)性(紀(jì)錄-106975，記錄-134172，記錄-112359，記錄-106582，記錄-111407，記錄-88247，記錄-135057，記錄-130652，記錄-130775)與產(chǎn)蛋性狀顯著相關(guān)(p<0.01)。這些新鑒定的SNP分別存放在NCBI dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)中，登錄號(hào)分別為1714766361、1714766362、1714766363、1714766364、1714766365、1714766367、1714766368和1714766370。

產(chǎn)蛋性能多標(biāo)記回歸分析

在單標(biāo)記組合中，我們發(fā)現(xiàn)8個(gè)SNP對(duì)鵝卵數(shù)有顯著影響。采用線性回歸模型分析了多個(gè)顯著標(biāo)記對(duì)鵝產(chǎn)蛋性能的影響。8個(gè)SNP參與分析，以確定該性狀的基因組合或網(wǎng)絡(luò)(圖2)。建立了兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)，其中一個(gè)由兩個(gè)標(biāo)記組成，另一個(gè)由三個(gè)標(biāo)記組成。記錄-111407和記錄-106975被包括在兩個(gè)標(biāo)記網(wǎng)絡(luò)中(圖2A)。預(yù)測(cè)值(在矩形中左邊)與相應(yīng)的實(shí)際值(在矩形中為右)有很高的相關(guān)性(r=0.98，r=0.81)。記錄-111407和記錄-106975分別對(duì)產(chǎn)蛋性能表現(xiàn)出加性和顯性效應(yīng)。用TT基因型替代GG/GA，可使平均蛋數(shù)減少9.45。記錄-111407，A到T的轉(zhuǎn)換將導(dǎo)致卵數(shù)下降7.71。三個(gè)標(biāo)記網(wǎng)絡(luò)引入了一個(gè)額外的標(biāo)記記錄-112359，它對(duì)產(chǎn)蛋率表現(xiàn)出加性效應(yīng)(圖2B)。T代G使卵數(shù)減少5.16。

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攜帶產(chǎn)蛋相關(guān)SNP的新基因的鑒定

在上述8個(gè)候選基因的基礎(chǔ)上，對(duì)鵝的相關(guān)功能基因進(jìn)行了鑒定。首先，利用候選RAD標(biāo)簽對(duì)NCBI公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST搜索，獲取相應(yīng)的序列。然而，由于90-bp的RAD標(biāo)記太短，無(wú)法進(jìn)行有效的比對(duì)，因此沒(méi)有獲得明顯的匹配序列。因此，我們使用IPCR來(lái)擴(kuò)展候選RAD標(biāo)簽兩側(cè)的未知區(qū)域。延伸的序列被用于進(jìn)一步的BLAST。因?yàn)闆](méi)有可用的參考基因組信息對(duì)于鵝，我們主要使用檢索的鴨或雞序列用于鵝基因注釋。

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對(duì)于記錄-134172，IPCR獲得了1,964bp的側(cè)翼序列長(zhǎng)度。DNA序列與鴨和雞的同源性分別為94%和79%。根據(jù)記錄-134172的序列鑒定了KIAA1462基因。

記錄-112359的側(cè)翼序列長(zhǎng)度為2,164 bp。DNA序列與鴨和雞的同源性分別為93%和79%。Rho GTPase激活蛋白21(ARHGAP 21)基因是根據(jù)記錄-112359序列鑒定的。

對(duì)于記錄-106582，通過(guò)IPCR獲得2,623 b長(zhǎng)度的側(cè)翼序列。DNA用鴨和雞序列分別顯示81％和65％的同源性，根據(jù)記錄-106582的序列鑒定了ACYCoA合成酶家族成員2(ACSF2)基因。

對(duì)于記錄-111407，通過(guò)IPCR獲得了1,508bp的側(cè)翼序列長(zhǎng)度。DNA 序列與鴨和雞序列的同源性分別為80%和72%。 根據(jù)記錄-111407序列鑒定Astrotactin2（AS TN2）基因。

記錄-106975, 記錄-134172, 記錄-112359, 記錄-106582和記錄-111407的派生序列已存入GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)))，登錄號(hào)分別為KP271033, KP271035, KP271036, KP271032和KP271034。

對(duì)記錄-88247、記錄-135057和記錄-130775，通過(guò)IPCR獲得3,100 bp、1,300bp和4,711 bp的側(cè)翼序列。3個(gè)DNA序列與鴨序列的同源性分別為90%、93%和92%。記錄-88247和記錄-135057的DNA序列與雞的同源性分別為78%和82%。我們沒(méi)有從雞的全基因組shotgun contigs數(shù)據(jù)庫(kù)(分類號(hào)：9031)中找到記錄-130775相應(yīng)的序列。

討論

基于池的RAD排序

在本研究中，我們采用了一種經(jīng)濟(jì)有效的比較RAD排序方法來(lái)發(fā)現(xiàn)與鵝產(chǎn)蛋性能有關(guān)的SNP。在沒(méi)有參考基因組的動(dòng)物中挖掘SNP有許多研究。由于沒(méi)有參考基因組可供鵝使用，RAD測(cè)序提供了一種成本效益高的方法，可以在鵝基因組中發(fā)現(xiàn)大量的SNP。

轉(zhuǎn)換和顛換(ts/tv)的比值是DNA序列演化的一般性質(zhì)。對(duì)于已經(jīng)研究的所有基因組序列，人們注意到，轉(zhuǎn)換發(fā)生的頻率在比顛換高，因?yàn)檗D(zhuǎn)換不需要改變構(gòu)象。在本研究中，鵝的TS/TV比率為1.10，其符合轉(zhuǎn)換偏倚的規(guī)則。

下一代測(cè)序的淺測(cè)序深度是決定從序列數(shù)據(jù)生成基因型調(diào)用的質(zhì)量和測(cè)序成本的主要因素。Catchen等人(2011)模擬RAD-seq過(guò)程，以測(cè)試USTACKS識(shí)別三葉松粘背植物基因座的能力。他們證明，平均測(cè)序深度為20×和40×，是可靠的下一代測(cè)序測(cè)序深度，有較低的錯(cuò)誤率。在本研究中，LEBV組和HEBV組的平均測(cè)序深度分別為20×和17×，表明在深度上得到了可靠的測(cè)序結(jié)果。

與產(chǎn)蛋相關(guān)的SNP的發(fā)現(xiàn)

采用兩步策略，將基于池的RAD測(cè)序與個(gè)體驗(yàn)證相結(jié)合，在較大的種群中發(fā)現(xiàn)與產(chǎn)蛋相關(guān)的SNP。個(gè)體池的下一代測(cè)序(NGS)在基因組范圍內(nèi)的SNP發(fā)現(xiàn)中往往更有效，即使考慮到測(cè)序錯(cuò)誤，也能提供更準(zhǔn)確的等位基因頻率估計(jì)。DNA池NGS的成本效益更高的方法在各種研究中得到了廣泛的應(yīng)用，證明了DNA池的NGS允許在單個(gè)SNP上估計(jì)等位基因頻率，具有較高的準(zhǔn)確性，但文庫(kù)的構(gòu)建和測(cè)序工作相對(duì)較少。在我們的研究中，通過(guò)比較LEBV和HEBV DNA池中估計(jì)的等位基因頻率，我們確定了467個(gè)與產(chǎn)蛋量相關(guān)的SNP。在適用于AS-PCR的467個(gè)SNP中，有55個(gè)在LEBV和HEBV隊(duì)列中進(jìn)行了個(gè)體基因分型。10個(gè)SNP在兩組間有不同的等位基因分布，陽(yáng)性率為18.2%。與以前的研究相比，Turner等人(2010年)在蛇紋石和非蛇紋石土壤中檢測(cè)到擬南芥兩個(gè)DNA庫(kù)之間的840萬(wàn)個(gè)多態(tài)性。在840萬(wàn)個(gè)多態(tài)性中，96個(gè)在土壤類型之間的等位基因頻率差異大于80%。同時(shí)，在96個(gè)多態(tài)性的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)了81個(gè)基因。目前還沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)評(píng)估基于池測(cè)序的陽(yáng)性率多態(tài)數(shù)。然而，Gautier等人(2013) 基于池和個(gè)體的RAD測(cè)序數(shù)據(jù)評(píng)估等位基因頻率估計(jì)的準(zhǔn)確性。結(jié)果表明，DNA池測(cè)序是估算大量SNP位點(diǎn)等位基因頻率的一種經(jīng)濟(jì)有效的方法。朱等人(2012)實(shí)驗(yàn)證明，DNA池測(cè)序是一種非常強(qiáng)大和成本效益高的技術(shù)，可以在全基因組范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)SNP。

在本研究中，通過(guò)與小規(guī)模代表性個(gè)體的比較研究，進(jìn)一步驗(yàn)證了10個(gè)候選SNP在產(chǎn)蛋量較大的鵝群中的存在。8個(gè)SNP對(duì)蛋數(shù)有顯著影響，陽(yáng)性率為80%，小規(guī)模代表性比較與大規(guī)模驗(yàn)證具有較高的一致性。我們的結(jié)論是，基于池的RAD測(cè)序結(jié)合極具代表性的個(gè)體比較，是識(shí)別感興趣性狀的相關(guān)SNP的一種成本效益高的方法。

蛋產(chǎn)量的關(guān)聯(lián)分析

提高產(chǎn)蛋性能對(duì)于鵝的生產(chǎn)具有重要的意義。然而，由于繁殖力較低，表型選擇對(duì)提高產(chǎn)蛋率的效率較低。對(duì)所涉及的遺傳標(biāo)記或基因進(jìn)行鑒定，有助于提高這一低遺傳力的性狀。許多研究人員一直致力于研究鵝繁殖性狀的遺傳機(jī)制。姜等（2011）檢測(cè)到PRL基因的5"側(cè)翼區(qū)SNP，以尋找影響皖西白鵝繁殖性狀的遺傳標(biāo)記。Chen等人（2012年）揭示了PRLR第10外顯子中SNP與皖江白鵝卵子性能的顯著關(guān)聯(lián)。Xu等人（2013）進(jìn)行了新轉(zhuǎn)錄體組裝和基因表達(dá)分析，鑒定了大量與卵泡發(fā)育和生殖生物學(xué)相關(guān)的基因，包括膽固醇側(cè)鏈裂解酶和多巴胺β羥基。Kang等人(2014)證實(shí)了烯醇ASE1(ENO1)基因的表達(dá)與孕前鵝相比，在產(chǎn)卵鵝的卵巢表達(dá)高，在四川白鵝的卵巢卵泡中鑒定出ENO1基因的表達(dá)譜。在我們的研究中，我們清楚地證明了8個(gè)SNPs對(duì)鵝的產(chǎn)蛋性狀有顯著的影響。線性回歸進(jìn)一步揭示了產(chǎn)蛋數(shù)的兩個(gè)多重SNP網(wǎng)絡(luò)，涉及記錄-111407、106975和112359。模型預(yù)測(cè)與觀測(cè)值有較好的一致性，驗(yàn)證了這些SNP對(duì)蛋數(shù)的組合效果。以前的研究也報(bào)道了多個(gè)基因或標(biāo)記可以用來(lái)預(yù)測(cè)性狀。Jiang等人.(2009)通過(guò)對(duì)多個(gè)標(biāo)記物的回歸分析，證實(shí)了兩個(gè)基因或三個(gè)基因網(wǎng)絡(luò)顯著地影響了肉牛的5或8個(gè)性狀。Ghazalpour等人(2006)利用微陣列和遺傳標(biāo)記數(shù)據(jù)構(gòu)建了小鼠肝臟基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，并研究了幾個(gè)基因模塊與小鼠體重的關(guān)系。因此，這8個(gè)SNP，特別是記錄-111407、106975和112359的組合可以是用于選擇鵝產(chǎn)蛋性能的有希望的分子標(biāo)記。我們使用David生物信息學(xué)資源6.7和UniHI在線工具進(jìn)一步探討了MAGI-1，ARHGAP 21和ASTN 2的功能聯(lián)系，分別來(lái)自記錄-111407，106975和112359。分析結(jié)果表明，這些基因在任何信號(hào)通路或基因網(wǎng)絡(luò)中都沒(méi)有直接關(guān)聯(lián)。然而，MAG1-1和ARGAP21可以直接或間接地由分層(SFN)基因調(diào)節(jié)。據(jù)報(bào)道，在包括卵巢癌、子宮乳頭狀漿液癌、子宮平滑肌瘤、卵巢顆粒細(xì)胞瘤和類固醇細(xì)胞瘤的各種類型的人類疾病中，SFN的表達(dá)經(jīng)常丟失。Wang等人(2012)表明SFN的表達(dá)與雌激素和孕酮受體(ER和PR)呈負(fù)相關(guān)。Khongmanee等人(2013)顯示SFN在膽管癌細(xì)胞無(wú)凋亡耐藥中起重要作用。大量的證據(jù)表明MAGI-1和ARHGAP 21在疾病和生殖功能中發(fā)揮作用的可能性很大。

基因克隆

利用IPCR擴(kuò)增RAD標(biāo)記，結(jié)合鴨(TABID：8835)和雞(TABID：9031)公共數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)，共獲得5個(gè)新基因。與以往的研究相比，我們沒(méi)有檢測(cè)到FSHβ，PRL，GnRH，LH和 PRLR等明確的生殖相關(guān)基因。相反，我們發(fā)現(xiàn)三個(gè)新基因，MAGI-1，ARHGAP 21和KIAA 1462，可能在產(chǎn)蛋過(guò)程中起著重要的作用。實(shí)際上，RAD-測(cè)序是一種通過(guò)酶切來(lái)減少基因組表達(dá)的方法。這種方法得到的SNP僅代表整個(gè)基因組的一小部分。本研究從LEBV和HEBV DNA池中分別獲得884,827和942,117個(gè)RAD標(biāo)記。估計(jì)平均覆蓋率占整個(gè)基因組的~6.96% (1.1GB，Anas platyrunchos)，因此，上述已知的產(chǎn)蛋相關(guān)基因很有可能不能被列入所獲得的基因列表中。

對(duì)于MAG1-1基因，Kranjecetal(2014)證明在HPV-陽(yáng)性細(xì)胞中可促進(jìn)細(xì)胞-細(xì)胞接觸，具有抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)的功能凋亡。ARHGAP21優(yōu)先用作GTPase活化蛋白(GAP)，CDC42調(diào)節(jié)ARP2/3復(fù)合物。它位于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)或核周區(qū)域，參與細(xì)胞-細(xì)胞粘附形成和細(xì)胞遷移。KIAA1462是一種位于細(xì)胞核、胞漿和質(zhì)膜上的蛋白編碼基因。與KIAA1462相關(guān)的疾病包括動(dòng)脈疾病和冠狀動(dòng)脈疾病。Akashi等人(2011)鑒定KIAA 1462為一種新的蛋白，位于細(xì)胞與細(xì)胞的連接處，并得出結(jié)論：KIAA 1462在內(nèi)皮細(xì)胞與細(xì)胞的連接中的積累依賴于VE-cadherin介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞粘附。卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)是由膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞支持的，它們?cè)诼涯讣?xì)胞周圍建立了動(dòng)態(tài)和高度組織的細(xì)胞層。卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞之間的縫隙連接是復(fù)雜的，并且在卵母細(xì)胞生長(zhǎng)的支持、減數(shù)分裂停滯的維持以及整個(gè)卵泡上皮的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起主要作用。一個(gè)眾所周知的與細(xì)胞-細(xì)胞連接的建立相關(guān)的效應(yīng)是抑制細(xì)胞增殖。以上證據(jù)表明，這些基因(MAGI-1、ARHGAP 21和KIAA 1462)極有可能影響顆粒細(xì)胞的增殖和凋亡，進(jìn)而干擾卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)。此外，KIAA1462在減數(shù)分裂重組中起著非常重要的作用。Chowdhuryetal(2009)發(fā)現(xiàn)，在人的重組率中KIAA1462是與變異相關(guān)的六個(gè)基因位點(diǎn)中的一個(gè)。減數(shù)分裂中的失敗或錯(cuò)誤可能導(dǎo)致不育、流產(chǎn)或出生缺陷。

另外兩個(gè)克隆基因包括ACSF 2和ASTN2.ACSF 2是Acyl-CoA合成酶(ACS)家族成員，參與脂肪酸合成和三羧酸循環(huán)。ACSF 2是一種線粒體基質(zhì)酶，位于線粒體基質(zhì)中。ACSF 2基因在細(xì)胞代謝過(guò)程中的特征與線粒體功能有關(guān)，暗示ACSF 2基因可能在生殖過(guò)程中起一定作用。ASTN 2在移行性小腦顆粒神經(jīng)元中高表達(dá)。它在神經(jīng)元的功能中起著重要的作用。Lesch等人(2008)鑒定ASTN 2基因參與細(xì)胞粘附和神經(jīng)細(xì)胞通訊。Ahn等人(2010)發(fā)現(xiàn)一種來(lái)自ASTN 2基因內(nèi)含子的新的微RNA，并優(yōu)先在性腺中表達(dá)。

結(jié)論

我們將基于池的RAD測(cè)序策略應(yīng)用于鵝的SNP發(fā)現(xiàn)。通過(guò)個(gè)體關(guān)聯(lián)分析驗(yàn)證了8個(gè)與產(chǎn)蛋相關(guān)的SNP。以產(chǎn)蛋相關(guān)的SNP為基礎(chǔ)，克隆了5個(gè)鵝的新基因。我們的數(shù)據(jù)表明，這些SNP或基因可能是標(biāo)記輔助選擇動(dòng)物的候選標(biāo)記或靶標(biāo)。這些方法可以在其他生產(chǎn)動(dòng)物中進(jìn)行，可以提供給人類更高效、更好的動(dòng)物食用/使用。我們的研究還表明，分子方法可以有目的的使用(而不是)簡(jiǎn)單地確定一些生理級(jí)聯(lián)的分子機(jī)制。事實(shí)上，這方面的更多研究將有助于各種動(dòng)物的生產(chǎn)。