隔離的第五天，孤獨(dú)總是如影隨形，而且最近新冠又開(kāi)始爆發(fā)，很多地方都有了本土病例，就連天津也成為了重災(zāi)區(qū)，但是被隔離的我，只能祝愿，一切美好如期而至。好了，這一篇我們就來(lái)分享關(guān)于新冠的研究文章，文獻(xiàn)在SARS-CoV-2 infection triggers profibrotic macrophage responses and lung fibrosis,2021年11月發(fā)表于Cell，頂級(jí)期刊，我們就來(lái)看看新冠對(duì)人體的危害有哪些~~~

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了解一點(diǎn)新的內(nèi)容，纖維化致病功能的基因，如 SPP1、TGFB1、TGFBI、LGMN 和 CCL18。

In brief

SARS-CoV-2 感染，但不是甲型流感，會(huì)引發(fā)肺部的免疫學(xué)和病理學(xué)變化，這些變化是肺纖維化的標(biāo)志。 發(fā)現(xiàn)一部分 CD163⁺ 巨噬細(xì)胞驅(qū)動(dòng)這種纖維增殖性急性呼吸窘迫（看來(lái)巨噬細(xì)胞真的是幫倒忙）。

Highlights

• 單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞在 COVID-19 ARDS 的肺中積聚
• COVID-19 中的巨噬細(xì)胞表達(dá)與促纖維化功能相關(guān)的基因 （幫倒忙）
• Patients with severe COVID-19 ARDS display hallmarks of pulmonary fibrosis（肺纖維化）
• SARS-CoV-2 在巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)促纖維化轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組譜

SUMMARY

COVID-19 誘發(fā)的“急性呼吸窘迫綜合征”（ARDS）與長(zhǎng)期呼吸衰竭和高死亡率有關(guān)，但肺損傷的機(jī)制基礎(chǔ)仍未完全了解。在這里，使用功能性single-cell genomics,、免疫組織學(xué)和電子顯微鏡分析了兩組 COVID-19 ARDS 患者的肺部免疫反應(yīng)和肺部病理學(xué)。描述了表達(dá) CD163 的單核細(xì)胞衍生巨噬細(xì)胞的積累，這些巨噬細(xì)胞在 COVID-19 ARDS 期間獲得了促纖維化轉(zhuǎn)錄表型。基因集富集和計(jì)算數(shù)據(jù)整合揭示了 COVID-19 相關(guān)巨噬細(xì)胞與特發(fā)性肺纖維化中發(fā)現(xiàn)的促纖維化巨噬細(xì)胞群之間的顯著相似性。 COVID-19 ARDS 與肺纖維化的臨床、影像學(xué)、組織病理學(xué)和超微結(jié)構(gòu)特征相關(guān)。人類單核細(xì)胞暴露于 SARS-CoV-2，而不是甲型流感病毒或病毒 RNA 類似物，足以在體外誘導(dǎo)類似的促纖維化表型。總之，研究證明 SARS-CoV-2 引發(fā)了促纖維化巨噬細(xì)胞反應(yīng)和明顯的纖維增生性 ARDS。

INTRODUCTION

“嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒-2”（SARS-CoV-2）是“2019年冠狀病毒病”（COVID-19）的病原體，最初感染并在上呼吸道上皮細(xì)胞中復(fù)制。雖然 SARS-CoV-2 感染會(huì)導(dǎo)致大多數(shù)人出現(xiàn)輕度呼吸道疾病，但大約 5% 的患者會(huì)出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征 (ARDS)，這需要長(zhǎng)時(shí)間的呼吸支持并與高死亡率相關(guān)。ARDS 是一種臨床綜合征，定義為急性低氧血癥和雙側(cè)影像學(xué)混濁的組合，不能用心功能不全或容量超負(fù)荷解釋，發(fā)生在已知臨床損傷或出現(xiàn)新的呼吸道癥狀后 7 天內(nèi)。 ARDS 的病理生理學(xué)通常被視為對(duì)肺損傷的雙相或三相反應(yīng)。 最初的“滲出期”的特點(diǎn)是損傷誘導(dǎo)和骨髓細(xì)胞增殖的彌漫性肺泡損傷、屏障破壞和水腫。 隨后是第二個(gè)“增殖期”，以上皮細(xì)胞修復(fù)、液體重吸收和肺泡完整性恢復(fù)為標(biāo)志。 第三個(gè)“纖維化期”僅發(fā)生在一部分患者中，與呼吸衰竭和高死亡率有關(guān)。

COVID-19 引起的 ARDS 需要長(zhǎng)時(shí)間的機(jī)械通氣或體外膜肺氧合 (ECMO)，并且與高死亡率相關(guān)。盡管病毒載量下降，但呼吸衰竭和 ARDS 通常在癥狀出現(xiàn)后的第二周出現(xiàn)（怪不得需要隔離14天）。延遲發(fā)病表明 COVID-19 中的 ARDS 是由繼發(fā)性事件驅(qū)動(dòng)的，包括不適當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)。支持這一觀點(diǎn)的是，在嚴(yán)重的 COVID-19 中觀察到失調(diào)的全身和粘膜免疫反應(yīng)，特別是在骨髓細(xì)胞compartment中。一再提出，一部分 COVID-19 患者會(huì)出現(xiàn)有害的高炎癥狀態(tài)，單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞被認(rèn)為是這種炎癥綜合征的關(guān)鍵介質(zhì)。相比之下，對(duì)嚴(yán)重 COVID-19 的系統(tǒng)分析表明，炎性細(xì)胞因子的水平比非 COVID-19 誘發(fā)的 ARDS 可比隊(duì)列低一到兩個(gè)數(shù)量級(jí)，這對(duì)“細(xì)胞因子風(fēng)暴”的概念提出了質(zhì)疑''或''炎性巨噬細(xì)胞''綜合征。根據(jù)這一觀察結(jié)果，嚴(yán)重 COVID-19 患者外周血中的單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞群顯示出抑制表型。然而，地塞米松和抗白細(xì)胞介素 6 (IL-6)/抗 IL-6R 抗體或 janus 激酶 (JAK) 抑制劑等抗炎治療在重癥 COVID-19 早期給藥時(shí)可改善臨床結(jié)果，indicating that inflammatory mediators contribute to early organ injury in COVID-19.

除了在宿主防御和炎癥中的作用外，巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞還是組織修復(fù)、重塑和纖維化的重要介質(zhì)。不同的巨噬細(xì)胞表型與 ARDS 的不同階段有關(guān)。 炎性巨噬細(xì)胞被認(rèn)為是滲出期(exudative phase)肺損傷的關(guān)鍵傳播者，而調(diào)節(jié)性巨噬細(xì)胞，以前被稱為“交替激活”或“M2”巨噬細(xì)胞，與 ARDS 的增殖和纖維化階段有關(guān)。幾項(xiàng)研究 已經(jīng)報(bào)道了 COVID-19 中不同的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的積累，yet their functional contribution to ARDS remains unknown.

在這里，以單細(xì)胞分辨率研究嚴(yán)重 COVID-19 的肺免疫反應(yīng)。 分析描述了一種明顯的單核細(xì)胞衍生巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，其獲得的轉(zhuǎn)錄特征讓人聯(lián)想到在特發(fā)性肺纖維化 (IPF) 中發(fā)現(xiàn)的促纖維化巨噬細(xì)胞。 除了肺巨噬細(xì)胞中潛在的促纖維化程序外，還觀察到肌成纖維細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的顯著擴(kuò)張和活化，以及它們與肺巨噬細(xì)胞廣泛參與細(xì)胞間通訊網(wǎng)絡(luò)。 IPF 樣轉(zhuǎn)錄譜是由來(lái)自健康供體的單核細(xì)胞暴露于 SARS-CoV-2 而非甲型流感病毒 (IAV) 引起的。 與觀察到的巨噬細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)一致，臨床、組織學(xué)和超微結(jié)構(gòu)分析顯示廣泛的纖維化組織重塑，表明 COVID-19 相關(guān) ARDS 中的纖維增殖反應(yīng)加劇。

RESULTS

Pulmonary CD163⁺ macrophages accumulate in COVID-19 ARDS

使用功能性single-cell genomics（單細(xì)胞 RNA 測(cè)序 [scRNA-seq] 和單核 RNA 測(cè)序 [snRNAseq]）分析了來(lái)自 47 名重癥 COVID-19 患者的組織樣本和支氣管肺泡灌洗液（BAL）液樣本，多表位配體制圖 (MELC)、免疫熒光 (IF) 顯微鏡、免疫組織化學(xué) (IHC)、RNA 熒光原位雜交 (RNA-FISH) 和透射電子顯微鏡 (EM)，輔以臨床評(píng)估，包括肺力學(xué)和計(jì)算機(jī)斷層掃描 (CT) 成像（運(yùn)用的技術(shù)還挺多）。與之前的報(bào)道一致，肺尸檢樣本的組織病理學(xué)分析揭示了彌漫性肺泡損傷、纖維增殖反應(yīng)和機(jī)化性肺炎的特征。通過(guò) CD68⁺ 和血紅蛋白-觸珠蛋白清道夫受體 CD163⁺ 細(xì)胞的 IHC 和 IF 顯微術(shù)檢測(cè)到受損肺組織中巨噬細(xì)胞的積累。 CD68⁺ 細(xì)胞的定量顯示巨噬細(xì)胞密度顯著增加，并且在 COVID-19 中表達(dá) CD163 的巨噬細(xì)胞比例更高。通過(guò) RNA-FISH 和連續(xù) IHC 在上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中檢測(cè)到 SARS-CoV-2 RNA。為了詳細(xì)分析肺免疫細(xì)胞群，進(jìn)行了 MELC。用一組 22 種免疫細(xì)胞標(biāo)記物對(duì) 9 例致命 COVID-19 尸檢病例的肺組織樣本進(jìn)行染色，顯示髓細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)（CD45⁺、CD3^-、CD4^-、CD20^-，以及 CD11b、CD14、CD16、 CD66b、CD68、CD84、HLA-DR、TREM1）具有顯著的巨噬細(xì)胞clusters，與之前的報(bào)道一致。 MELC 證實(shí)了 CD163⁺ 巨噬細(xì)胞的積累，其中一些共表達(dá)趨化因子受體 CXCR3 和補(bǔ)體因子 C1Q。此外，注意到膠原蛋白的顯著沉積。

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Monocyte-derived macrophages adopt a damage response signature in severe COVID-19

為了在重癥 COVID-19 期間獲得更高分辨率的肺免疫反應(yīng)，分析了 COVID-19 相關(guān) ARDS 患者 BAL 細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組。 與肺組織的尸檢分析一致并與先前的報(bào)告一致，我們確定了骨髓細(xì)胞的主要比例，特別是中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞。 SARS-CoV-2 轉(zhuǎn)錄本主要在單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞中檢測(cè)到。

詳細(xì)分析揭示了六個(gè)具有不同基因表達(dá)譜的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞群。 “FCN1-單核細(xì)胞”（FCN1-Mono）表達(dá)高水平的 ficolin-M（FCN1）和 CD14，但表達(dá)低水平的 FCGR3A，編碼 CD16a。 FCN1-Mono 的特點(diǎn)是alarmins（S100A8、S100A12）、選定的炎性細(xì)胞因子（IL1B、IL6、CXCL8）和單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1/CCL2）受體 CCR2 的高表達(dá)。值得注意的是，F(xiàn)CN1-Mono 還表達(dá) TGFB1，編碼 TGF-b，一種傷口愈合和修復(fù)的主要調(diào)節(jié)因子，及其下游靶標(biāo) TGFBI。相鄰的“Mono/MΦ”群體表現(xiàn)出不太明顯的表型，表明存在短暫的分化狀態(tài)。 Mono/MΦ 和相鄰的單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞群表達(dá)高水平的 SPP1，編碼Osteopontin，一種多功能基質(zhì)細(xì)胞蛋白和在各種病理中在巨噬細(xì)胞中表達(dá)的細(xì)胞因子。 SPP1⁺ 巨噬細(xì)胞群由 CD163 和 LGMN 的高表達(dá)定義，編碼 Legumain，此后被稱為“CD163/LGMN-MΦ”。還鑒定了三種類型的肺泡巨噬細(xì)胞（AMΦ1、AMΦ2 和增殖性 AMΦ），其特征是 FABP1、FABP4 和 MARCO 的高表達(dá)，這是 AMΦ 的特征。 AMΦ-2 表達(dá)高水平的 TGF-b 家族成員“抑制素 beta A”（INHBA），而“增殖-AMΦ”表達(dá)細(xì)胞周期相關(guān)基因（MKI67、TOP2A、NUSAP1）。

轉(zhuǎn)錄分析表明浸潤(rùn)性單核細(xì)胞（FCN1-Mono）沿曲線向CD163/LGMN-MΦ、AMΦ1和AMΦ2方向分化。單核細(xì)胞趨化因子 CCL2 在 FCN1-Mono、Mono/MΦ 和 CD163/LGMN-MΦ 中的顯著表達(dá)表明單核細(xì)胞募集和隨后的巨噬細(xì)胞分化的前饋循環(huán)。

巨噬細(xì)胞群的特征在于與 TGF-b 信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的基因（TGFB、TGFBI、INHBA、NRP1）、清道夫受體和與凋亡細(xì)胞攝取相關(guān)的分子（MRC1、CD163、MERTK、TREM2、MARCO）、脂質(zhì)處理和 - 代謝（PLA2G7、APOC、APOE、LIPA、LPL、FBP1、FABP4）和參與 ECM 相互作用和分解的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）成分或分子（FN、VCAN、SPP1、LGMN、MMP9、SDC3）。 使用ChEA3工具的轉(zhuǎn)錄因子富集分析預(yù)測(cè)SPI1（編碼PU.1）在FCN1-Mono和轉(zhuǎn)錄因子EC（TFEC）和CD163/LGMN-MΦ的糖基化溶酶體膜蛋白（GLMP）中具有調(diào)節(jié)作用，而核受體過(guò)氧化物酶體增殖物- 參與肺泡巨噬細(xì)胞分化、脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)和抑制炎癥巨噬細(xì)胞反應(yīng)的活化受體 γ (PPARg) 被預(yù)測(cè)控制 AMΦ1 和 AMΦ2 中的轉(zhuǎn)錄（看來(lái)功能分析是必不可少的）。

在來(lái)自嚴(yán)重 COVID-19 ARDS 患者的第二組 BAL 樣本中證實(shí)了這些發(fā)現(xiàn)，揭示了相似的巨噬細(xì)胞群。 FCN1-Mono、Mono-MΦ 和 CD163/LGMN-MΦ 在 COVID-19 ARDS 的前 4 周占主導(dǎo)地位，AMΦ1 和 AMΦ2 在疾病后期重新填充肺泡室。 為了進(jìn)一步驗(yàn)證，將隊(duì)列中鑒定的巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄表型與之前發(fā)表的 COVID-19 肺巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了比較。 在所有三個(gè) COVID-19 數(shù)據(jù)集中發(fā)現(xiàn)了高度相似的巨噬細(xì)胞譜，證實(shí)了具有損傷反應(yīng)和組織修復(fù)特征的單核細(xì)胞衍生巨噬細(xì)胞的積累是 COVID-19 ARDS 的一個(gè)共同特征。

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Pulmonary macrophages in COVID-19 adopt a profibrotic phenotype(纖維化的表型)

單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的錯(cuò)誤損傷修復(fù)和傷口愈合反應(yīng)在組織重塑、瘢痕形成和纖維化中起關(guān)鍵作用。肺纖維化中纖維化生態(tài)位內(nèi)的巨噬細(xì)胞表達(dá)共享的轉(zhuǎn)錄程序。 因此，從四個(gè)已發(fā)表的肺纖維化數(shù)據(jù)集中評(píng)估了重癥 COVID-19 中單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞與巨噬細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)錄相似性。 除了基因集之間的過(guò)度代表性分析外，還根據(jù)基因集表達(dá)計(jì)算了基于細(xì)胞的分?jǐn)?shù)，并評(píng)估了群體間的差異。 這些比較表明，CD163/LGMN-MΦ群與 IPF 特異性巨噬細(xì)胞表型非常相似，而 FCN1-Mono 和 AMΦ1 和 AMΦ2 分別更類似于穩(wěn)態(tài)單核細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞。

為了直接比較 COVID-19 相關(guān)和 IPF 相關(guān)巨噬細(xì)胞的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，將我們的 scRNA-seq 數(shù)據(jù)與另一個(gè) COVID-19 數(shù)據(jù)集與兩個(gè)包含 IPF、COPD（慢性阻塞性肺病）的 scRNA-seq 數(shù)據(jù)集相結(jié)合，并使用single-cell variational inference (scVI) 控制樣本。 138,341 個(gè)巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的聯(lián)合嵌入揭示了 CD163/LGMN-MΦ和增殖性 AMΦ種群與 IPF 相關(guān)巨噬細(xì)胞的顯著相似性。 IPF 和 COVID-19 相關(guān)巨噬細(xì)胞均表達(dá)具有眾所周知的纖維化致病功能的基因，如 SPP1、TGFB1、TGFBI、LGMN 和 CCL18?；?k-最近鄰分類器的鄰近分析顯示 CD163/LGMN-MΦ 和增殖-AMΦ 與 IPF 相關(guān)巨噬細(xì)胞具有顯著相似性（相對(duì)分?jǐn)?shù)分別為 0.66 和 0.83；調(diào)整后的 p < 0.0001；Fisher 精確檢驗(yàn)，one-tailed)。 AMΦ2 (0.63) 和 FCN1-Mono (0.47) 類似于穩(wěn)態(tài)肺泡巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞，嵌入健康肺部的巨噬細(xì)胞附近。分析已發(fā)表的 COVID-19 數(shù)據(jù)集獲得了類似的結(jié)果，證實(shí)對(duì)應(yīng)于 CD163/LGMN-MΦ的單核細(xì)胞衍生巨噬細(xì)胞 (MoM3) 與 IPF 相關(guān)巨噬細(xì)胞具有高度相似性。

Gene set overrepresentation, scRNA-seq data integration, and proximity analyses revealed that pulmonary CD163/LGMN-MΦ in COVID-19 showed significant transcriptional similarity with macrophages found in IPF. The data indicate that newly recruited monocyte-derived macrophages in COVID-19 adopt a fibrosis-associated phenotype.

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Interaction of pulmonary macrophages and mesenchymal cells in COVID-19 ARDS（相互作用）

為了進(jìn)一步研究肺巨噬細(xì)胞群與纖維化反應(yīng)的關(guān)聯(lián)，分析了來(lái)自postmortem COVID-19 患者的死后肺組織樣本。 使用 snRNA-seq，我們根據(jù)典型標(biāo)記基因鑒定了 15 個(gè)不同的肺細(xì)胞群。我們發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞表型與 BAL 中描述的相似，以及周細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞。 成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞在 COVID-19 中表現(xiàn)出強(qiáng)烈的 ECM 蛋白編碼基因上調(diào)，特別是在疾病的后期（第 34-82 天），表明強(qiáng)烈的纖維化反應(yīng)。 接下來(lái)，使用配體-受體相互作用工具 CellChat 推斷了巨噬細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞之間的通信網(wǎng)絡(luò)。 分析揭示了 CD163/LGMN-MΦ 以及在較小程度上 Mono/MΦ 與肌成纖維細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和周細(xì)胞的強(qiáng)相互作用。 相對(duì)于疾病的早期階段（第 7-21 天），相互作用強(qiáng)度在較晚的時(shí)間點(diǎn)（第 34-82 天）增加。 信息流分析顯示參與了有效的促纖維化途徑，包括 Col、FGF（成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子）、TGFB1 和 SPP1 等。

接下來(lái)通過(guò) IF 在尸檢肺樣本中評(píng)估 SM22⁺ 肌成纖維細(xì)胞和 CD68⁺ 巨噬細(xì)胞的組織分布。 與非 COVID-19 對(duì)照相比，肌成纖維細(xì)胞擴(kuò)增，并且經(jīng)常在 SM22⁺ 基因座附近發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞。 我們還注意到 CD163⁺ 巨噬細(xì)胞和膠原蛋白沉積的顯著共定位。 然而，膠原蛋白區(qū)域和巨噬細(xì)胞的擴(kuò)張?jiān)黾恿斯捕ㄎ坏目赡苄裕?strong>空間共定位分析還是很重要的）。

In summary, we found that pulmonary macrophages colocalized with collagen and myofibroblast loci and engaged in strong signal interactions with myofibroblasts, fibroblasts, and pericytes. Interactions between CD163/LGMN-MΦ and mesenchymal cells may thus contribute to a highly profibrotic milieu in COVID-19 ARDS.（總之，我們發(fā)現(xiàn)肺巨噬細(xì)胞與膠原蛋白和肌成纖維細(xì)胞基因座共定位，并與肌成纖維細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和周細(xì)胞進(jìn)行強(qiáng)信號(hào)相互作用。 因此，CD163/LGMN-MΦ 和間充質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用可能導(dǎo)致 COVID-19 ARDS 中的高度纖維化環(huán)境。）

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COVID-19 is associated with pronounced fibroproliferative ARDS

在 COVID-19 ARDS 中鑒定巨噬細(xì)胞中與纖維化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄特征及其與間充質(zhì)細(xì)胞的相互作用促使我們?cè)u(píng)估 COVID-19 中肺纖維化的證據(jù)?？傊?，揭示了在嚴(yán)重的 COVID-19 相關(guān) ARDS 期間具有明顯的通氣、放射學(xué)、組織學(xué)和超微結(jié)構(gòu)特征的肺瘢痕和纖維化的加劇的纖維增殖反應(yīng)。

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SARS-CoV-2 triggers a fibrosis-associated transcriptional profile in monocytes

傷口愈合和纖維化的關(guān)鍵介質(zhì)，包括 TGF-β，在組織損傷和凋亡細(xì)胞攝取后在吞噬細(xì)胞中被誘導(dǎo)。因此，巨噬細(xì)胞中的纖維化損傷反應(yīng)特征可能是由 ARDS 期間的廣泛肺損傷和呼吸機(jī)引起的肺損傷引起的。由于在巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了 SARS-CoV-2 轉(zhuǎn)錄物，特別是在 CD163/LGMN-MΦ中，測(cè)試了病毒接觸是否可能直接引發(fā)單核細(xì)胞中的纖維化相關(guān)特征。我們用 SARS-CoV-2 刺激從健康供體分離的經(jīng)典 (CD14⁺CD16^-) 單核細(xì)胞 18 小時(shí)，并通過(guò) scRNA-seq 分析了多路復(fù)用實(shí)驗(yàn)條件（通過(guò)標(biāo)簽寡核苷酸 [HTO]）和供體（通過(guò)單個(gè)核苷酸多態(tài)性 [SNP]) 以最小化批次效應(yīng)。我們納入了病毒 RNA 傳感器、視黃酸誘導(dǎo)基因 I (RIG-I) 和黑色素瘤分化相關(guān)蛋白 5 (MDA5) 激動(dòng)劑 30-ppp-hairpin-RNA (3p-hpRNA) 和 R848（Toll-的雙重激動(dòng)劑）的配體。類似受體 (TLR)-7/-8，用于比較。我們觀察到對(duì) 3p-hpRNA、R848 和 SARS-CoV-2 的不同反應(yīng)。單核細(xì)胞對(duì) SARS-CoV-2 的反應(yīng)是不同的，但與 3p-hpRNA 刺激部分重疊，表明 SARS-CoV-2 有可能通過(guò) RIG-I 樣受體引發(fā)適度的 I 型干擾素 (IFN) 反應(yīng)。值得注意的是，在 COVID-19 和肺纖維化中發(fā)現(xiàn)的幾個(gè)肺巨噬細(xì)胞特征基因，包括 MRC1、CD163、MERTK、LGMN 和 MMP9，在暴露于 SARS-CoV-2 后被特異性誘導(dǎo)。 SARS-CoV-2 還誘導(dǎo)了 TGF-b 家族基因 NRP1 和 TGFBI。 NRP1 促進(jìn) SARS-CoV-2 的宿主細(xì)胞結(jié)合和進(jìn)入；然而，盡管 SARS-CoV-2 刺激的單核細(xì)胞中有大量病毒轉(zhuǎn)錄物，但我們沒(méi)有發(fā)現(xiàn)生產(chǎn)性感染的證據(jù)。與 R848 相比，SARS-CoV-2 刺激僅誘導(dǎo)了 IL1B 的有限表達(dá)，而沒(méi)有誘導(dǎo) IL6。轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)揭示了 SARS-CoV-2 刺激的單核細(xì)胞與肺 CD163/LGMN-MΦ巨噬細(xì)胞在 COVID-19 ARDS 中的重疊，包括 TFEC、GLMP 和 HLX（H2.0 樣同源盒蛋白）的預(yù)測(cè)參與。

鑒于 SARS-CoV-2 暴露的單核細(xì)胞和 CD163/LGMN-MΦ中基因表達(dá)的重疊，我們?cè)u(píng)估了 IPF 相關(guān)巨噬細(xì)胞基因組的潛在富集。 纖維化相關(guān)巨噬細(xì)胞基因特征在 SARS-CoV-2 暴露的單核細(xì)胞中特異性富集，但在 30-hpRNA 刺激、R848 刺激或未刺激的對(duì)照單核細(xì)胞中不富集。 發(fā)現(xiàn) SARS-CoV-2 刺激的單核細(xì)胞和 IPF 相關(guān)巨噬細(xì)胞（包括 IPF 特異性clusters）中的基因表達(dá)高度相似。 這些結(jié)果表明，SARS-CoV-2 直接觸發(fā)了人類單核細(xì)胞中類似于纖維化相關(guān)肺巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜。

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SARS-CoV-2 triggers a profibrotic proteome profile in monocytes

為了驗(yàn)證和說(shuō)明這些發(fā)現(xiàn)，進(jìn)行了多重定量鳥(niǎo)槍法蛋白質(zhì)組學(xué)，它可以提供與細(xì)胞表型高度相關(guān)的數(shù)據(jù)。 用 SARS-CoV-2 或 IAV (H3N2) 刺激從健康供體分離的單核細(xì)胞，這已在蛋白質(zhì)組水平上得到充分研究。 感染后 1、3 和 18 小時(shí) (hpi) 的分析可重復(fù)地量化了來(lái)自 4 個(gè)供體的 2 個(gè)重復(fù)中的 6,951 個(gè)蛋白質(zhì)和 5,299 個(gè)磷酸化位點(diǎn)。 與 IAV 有效感染單核細(xì)胞的能力一致，我們發(fā)現(xiàn) IAV 蛋白隨著時(shí)間的推移而增加。 相比之下，SARS-CoV-2 蛋白保持不變或減少。 只有 SARS-CoV-2 M 蛋白 (VME1) 顯示適度增加，表明存在一些殘留的病毒轉(zhuǎn)錄和翻譯(實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的部分我們就不展開(kāi)了)。

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DISCUSSION

嚴(yán)重 COVID-19 相關(guān) ARDS 的病理機(jī)制仍未完全了解。在這里，報(bào)告了單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞的積累，這些巨噬細(xì)胞具有豐富的纖維化相關(guān)基因特征，并且與嚴(yán)重 COVID-19 期間肺部 IPF 中發(fā)現(xiàn)的巨噬細(xì)胞群具有顯著相似性。值得注意的是，SARS-CoV-2 足以在體外誘導(dǎo)經(jīng)典單核細(xì)胞中的類似分化程序，這表明病毒接觸可能構(gòu)成促纖維化巨噬細(xì)胞重編程的觸發(fā)因素。這些發(fā)現(xiàn)得到了定量蛋白質(zhì)組學(xué)的證實(shí)，并擴(kuò)展到翻譯后改變，包括 CEBPB 異構(gòu)體比率，這也與纖維化有關(guān)。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，我們觀察到限制性通氣缺陷和鞏固和纖維化重塑的放射學(xué)跡象，組織病理學(xué)顯示肌成纖維細(xì)胞和成纖維細(xì)胞擴(kuò)張以及明顯的 ECM 沉積。這些發(fā)現(xiàn)與臨床觀察一致，即 COVID-19 ARDS 患者需要長(zhǎng)期呼吸支持和 ECMO 治療，并且與其他形式的 ARDS 相比，死亡率更高。我們的研究描述了嚴(yán)重 COVID-19 中肺巨噬細(xì)胞的主要纖維化特征，并伴有嚴(yán)重的纖維化肺組織重塑。這與之前關(guān)于 COVID-19 ARDS 患者甚至最初患有輕度或中度疾病的個(gè)體的組織性肺炎、瘢痕形成和纖維化的報(bào)告一致。

雖然 IPF 的特征是慢性進(jìn)行性、不可逆的纖維化，但 COVID-19 誘導(dǎo)的纖維化組織重塑發(fā)生迅速，并且在大多數(shù)幸存者中至少部分可逆。然而，這兩種情況具有相似的流行病學(xué)風(fēng)險(xiǎn)因素，包括年齡較大、男性、吸煙史和其他合并癥。病毒感染也反復(fù)與 IPF 的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，并作為急性加重的誘因。此外，IPF 急性加重的特點(diǎn)是雙側(cè) GGO 和彌漫性肺泡損傷的證據(jù)，這表明病毒感染和隨后的纖維化增強(qiáng)。我們的數(shù)據(jù)揭示了 IPF 和嚴(yán)重 COVID-19 ARDS 的意想不到的共同特征，即易感個(gè)體的異常巨噬細(xì)胞活化和不適當(dāng)?shù)睦w維增殖反應(yīng)。單核細(xì)胞和促纖維化巨噬細(xì)胞在 ARDS 和肺纖維化的發(fā)病機(jī)制和進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。循環(huán)單核細(xì)胞數(shù)量已被提議作為 IPF 的預(yù)后生物標(biāo)志物，并且 CCR2 的基因缺失或單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞的消耗可保護(hù)小鼠免受藥物誘導(dǎo)的肺纖維化。 CD163⁺ 巨噬細(xì)胞的積累與 IPF 的不良結(jié)果有關(guān)。 CD163/LGMN-MΦ 表達(dá)高水平的骨橋蛋白（由 SPP1 編碼），這是一種分泌的 ECM 磷酸糖蛋白，它還兼作刺激成纖維細(xì)胞中膠原蛋白-I 產(chǎn)生并在 IPF 中發(fā)揮促纖維化功能的細(xì)胞因子。 TGFB1（編碼 TGF-b）是傷口愈合和器官纖維化的主要調(diào)節(jié)因子，以及幾個(gè) TGF-b 相關(guān)基因，包括 TGFBI 和 NRP1，也在 CD163/LGMN-MΦ 中高表達(dá)。巨噬細(xì)胞衍生的 TGFBI 通過(guò)抑制抗纖維化金屬蛋白酶 14 (MMP14) 促進(jìn)成纖維細(xì)胞中的膠原蛋白生成并抑制膠原蛋白更新。 Legumain (LGMN) 是一種天冬酰胺內(nèi)肽酶，參與 MMP 活化、TGF-b 信號(hào)傳導(dǎo)和 ECM 沉積，在器官纖維化中起重要作用。 LGMN 在 CD163/LGMN-MΦ 和 IPF 的促纖維化巨噬細(xì)胞中高度表達(dá)，并且在暴露于 SARS-CoV-2 后在單核細(xì)胞中被強(qiáng)烈誘導(dǎo)。

證明了暴露于 SARS-CoV-2 而不是 IAV 會(huì)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組譜與 IPF 相關(guān)巨噬細(xì)胞具有高度相似性，我們還在肺巨噬細(xì)胞中檢測(cè)到 SARS-CoV-2 轉(zhuǎn)錄本。這些發(fā)現(xiàn)表明，SARS-CoV-2 可能直接導(dǎo)致嚴(yán)重 COVID-19 中的促纖維化巨噬細(xì)胞表型。其他因素可能會(huì)在后期傳播纖維化巨噬細(xì)胞反應(yīng)，但纖維化組織狀態(tài)可以通過(guò)強(qiáng)烈的初始沖動(dòng)觸發(fā)進(jìn)入病理穩(wěn)定性，并且通常會(huì)緩慢消退。通過(guò)誘導(dǎo) TGF-β 識(shí)別組織損傷和攝取凋亡細(xì)胞是傷口愈合和促纖維化反應(yīng)的已知刺激。 COVID-19 中的肺巨噬細(xì)胞表達(dá)了一系列參與細(xì)胞增多癥的清道夫受體和蛋白質(zhì)，包括 MRC1、CD163、TREM2 和 MERTK 等，以及高水平的 TGFB1 和 TGFBI。因此，SARS-CoV-2 感染誘導(dǎo)基因表達(dá)，這些基因可能直接和間接促進(jìn)巨噬細(xì)胞的促纖維化功能。這些損傷修復(fù)反應(yīng)可能有利于控制炎癥組織損傷。然而，未經(jīng)檢查和異常，它們可能會(huì)導(dǎo)致易感個(gè)體的纖維增生增強(qiáng)和呼吸衰竭延長(zhǎng)。在這方面，重要的是評(píng)估 CD163/LGMN-MΦ 的存在及其在輕度 COVID-19 患者中的命運(yùn)。

以前曾報(bào)道過(guò) COVID-19 的肺部后遺癥，包括纖維化，但確切的疾病負(fù)擔(dān)仍不清楚。最近對(duì)先前因 COVID-19 住院的 1,733 名患者進(jìn)行的為期 6 個(gè)月的隨訪顯示，中位 6 分鐘步行距離縮短，擴(kuò)散能力和總肺活量下降，表明存在限制性通氣缺陷。這在嚴(yán)重疾病后更為明顯，不包括接受 ECMO 或器官支持的患者。此外，有幾份報(bào)告稱輕至中度 SARS-CoV-2 感染后出現(xiàn)嚴(yán)重的進(jìn)行性肺纖維化。識(shí)別有發(fā)生 COVID-19 纖維化并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)的患者并制定早期干預(yù)策略（包括潛在的抗纖維化療法）非常重要。阻斷單核細(xì)胞流入也可能是一種有吸引力的策略。另一方面，很明顯，隨著時(shí)間的推移，在 COVID-19 ARDS 存活的患者中，纖維化病變會(huì)消退或部分消退。因此，恢復(fù)階段可能提供一個(gè)獨(dú)特的窗口來(lái)研究纖維化消退的分子機(jī)制。

Method（關(guān)注一些重點(diǎn)方法）

Single-cell RNA-seq data analysis

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Single-nucleus RNA-seq

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Data integration

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生活很好，有你更好