CoIP的原理圖
文獻信息：
Abe, T., et al. (2017). "Germ-Cell-Specific Inflammasome Component NLRP14 Negatively Regulates Cytosolic Nucleic Acid Sensing to Promote Fertilization." Immunity 46(4): 621-634.
文獻截圖
先看一下圖中的縮寫：
IP全稱是immunoprecipitation，即免疫沉淀，這一步主要是為了純化目的蛋白。
IB全稱是immunoblotting，即免疫印跡，也就是常規(guī)的Western Blotting，用于顯示目的蛋白。
WCL全稱是whole cell lysates，即整個細胞的裂解成分。
HC全稱是heavy chain，即重鏈，
LC全稱是light chain，即輕鏈。
結果查看
將圖分為三部分，先看第一部分，即上面的部分，“+”表示含有這種蛋白，“-”表示沒有，這個實驗一共做了四組，從左到右分別為：①只表達HA-cGAS的293T細胞；②共同表達HA-cGAS與NRLP14-FL的293T細胞；③只表達STING-HA的293T細胞；④共同表達STING-HA與與NRLP14-FL的293T細胞，如下所示：
再看第二部分WB的圖，WB的圖就是使用含有FLAG抗體的珠子拉下來的蛋白做的，使用拉下來的這些蛋白再做WB，它的原理前面已經描述過了。使用FLAG抗體的珠子拉下來的蛋白使用HA抗體來進行檢測，其結果如下：
從上面的圖像可以看出以下信息：
第一， HC與LC條帶都非常明顯，之所以出現(xiàn)這個條件是因為，在WB之前進行的蛋白變性這一步，由于加樣緩沖液中含有巰基乙醇，巰基乙醇會把抗體的重鏈和輕鏈之間的二硫鍵破壞，從而使的抗體變成重鏈分子55KD和輕鏈分子25KD，因此會在結果中呈現(xiàn)兩個條帶。
第二， 第一組（只表達HA-cGAS的293T細胞）中沒有條帶，第二組（共同表達HA-cGAS與NRLP14-FL的293T細胞）沒有條帶，第三組（只表達STING-HA的293T細胞）有一點點條帶，第四組（共同表達STING-HA與與NRLP14-FL的293T細胞）條帶明顯，這說明NLRP14與STING有相互作用，為什么說有相互作用呢？因為我們是用FLAG抗體來拉的蛋白，從理論上講，我們只能拉下FLAG標記的NLRP14，也就是NLRP14-FL（FL就是FLAG），但是，從拉下的蛋白中用HA進行檢測，居然檢測出來了HA標記的STING，這就說明，使用FLAG拉NLRP14-FL時，這個蛋白復合物中含有STING-HA。
再看圖的第三部分，也就是下面的這一部分，是用FLAG抗體和HA抗體來進行檢測整個細胞的裂解液，是作為陽性對照（有的文獻中會標明input組），如下所示：
其中右側的WCL表示的是整個細胞的裂解液，也就是還沒有使用FLAG抗體的珠子去拉的時候的樣本，也就是說直接裂解了293T細胞后的樣本，從這個結果中可以得到以下信息：
第一， 在使用FLAG抗體進行檢測全蛋白時，相當于陽性對照。第一組（只表達HA-cGAS的293T細胞）中沒有條帶，因為這種293T細胞中只有HA標記的cGAS，第二組（共同表達HA-cGAS與NLRP14-FL的293T細胞）有條帶，因為FLAG抗體能檢測出使用了FLAG標記的NLRP14，NLRP14的蛋白分子量大概是125kD，第三組（只表達STING-HA的293T細胞）沒有條帶，因此這種293T細胞只表達HA標記的STING；第四組（共同表達STING-HA與與NLRP14-FL的293T細胞）條帶明顯，因為這個細胞中含有FLAG標記的NLRP14。
第二， 使用HA抗體檢測全蛋白，這是陽性對照，是說明細胞中含有相應的蛋白。我們可以發(fā)現(xiàn)，第一組（只表達HA-cGAS的293T細胞）在27kD附近沒有條件，在50kD部分有條帶，這說明，全蛋白中含有HA標記的cGAS（cGAS的蛋白分子量是62kD，多數(shù)蛋白標簽的分子量很少，基本可以忽略），做這個實驗主要是作為陽性對照；第二組（共同表達HA-cGAS與NLRP14-FL的293T細胞）在37kD附近沒有條帶，在50kD附近有條帶；結合前面的結果來看，就說明這個細胞中含有HA標記的cGAS（因為它的分子量大概是50kD），還含有FALG標記的NLRP14（因為NLRP14的蛋白分子量大概是125kD）；第三組（只表達STING-HA的293T細胞）在37kD處有條帶，這說明細胞中含有HA標記的STING（因為STING的分子量大概是35kD）；第四組（共同表達STING-HA與與NLRP14-FL的293T細胞）在110kD處有條帶，在37kD處也有條帶，這說明這種細胞中含有NLRP14與STING。
從上面的圖片可以知道，在做Co-IP實驗時。需要設立陽性對照組來證明你的細胞中有某個蛋白A與B，再使用抗蛋白A的抗體來拉A蛋白，再使用抗蛋白B的抗體來檢測拉下來的蛋白，如果檢測到了蛋白B，就說明蛋白A與蛋白B有相互作用。
