Gene signature of circulatingplatelet-bound neutrophils is associated with poor prognosis in cancer patients

循環(huán)血小板結(jié)合的中性粒細(xì)胞的基因特征與癌癥患者的預(yù)后不良有關(guān)

發(fā)表期刊：Int J Cancer

發(fā)表日期：2022 Mar 7

DOI：10.1002/ijc.33991

期刊相關(guān)信息

一、背景

????????除了在止血中的關(guān)鍵作用外，血小板還與中性粒細(xì)胞發(fā)生物理相互作用，形成中性粒細(xì)胞-血小板聚集體（NPA），在炎癥期間增強(qiáng)中性粒細(xì)胞效應(yīng)器的功能。NPA還可能促進(jìn)各種炎癥性疾病的病情惡化。然而，癌癥中NPA的特征仍然完全未被探索。????

????????循環(huán)中性粒細(xì)胞的一個(gè)亞群——低密度中性粒細(xì)胞（LDN）在癌癥患者的血液中擴(kuò)散與預(yù)后較差相關(guān)，尤其是在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）和頭頸癌（HNC）中。此外，發(fā)現(xiàn)相比于正常密度中性粒細(xì)胞（NDN），LDN顯示出腫瘤中性粒細(xì)胞增強(qiáng)T細(xì)胞抑制功能。

二、數(shù)據(jù)來(lái)源和實(shí)驗(yàn)方法

1.數(shù)據(jù)來(lái)源

1）六名轉(zhuǎn)移性NSCLC患者的全血；以年齡和性別匹配的對(duì)照組來(lái)自健康獻(xiàn)血者（HD）的全血。

2）六名非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者全血白細(xì)胞的ScRNA-seq數(shù)據(jù)（GSE127465）的CPM基因表達(dá)矩陣；健康獻(xiàn)血者（HDs）全血白細(xì)胞的ScRNA-seq數(shù)據(jù)(GSE145230)的CPM基因表達(dá)矩陣。

2.實(shí)驗(yàn)方法

1）全血、NDNs和LDNs富集部分的制備，用于多光譜成像流式細(xì)胞儀；May Grünwald Giemsa染色

2）非小細(xì)胞肺癌患者（NSCLC）和健康獻(xiàn)血者（HDs）全血白細(xì)胞的ScRNAseq數(shù)據(jù)預(yù)處理

3）差異性基因表達(dá)分析：從GSE127465 CPM基因表達(dá)矩陣生成的Seurat對(duì)象中，使用Seurat R軟件包中的FindAllMarkers功能對(duì)兩個(gè)不同集群之間進(jìn)行差異基因表達(dá)分析

4）批量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的單樣本基因集富集分析（ssGSEA）：GSVA R包中的SsGSEA對(duì)體外刺激和非刺激中性粒細(xì)胞（GSE15139和GSE49757）的公共微陣列數(shù)據(jù)進(jìn)行分析

5）基于scRNAseq數(shù)據(jù)的單樣本基因集富集分析（ssGSEA）并繪制barplot：escape包中的ssGSEA用于計(jì)算所有單個(gè)細(xì)胞的血小板特征“Raghavachari”和中性粒細(xì)胞特征“in house 11 genes”的富集分?jǐn)?shù)。

6）MCP count on scRNAseq data

7）生存分析

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.癌癥患者和健康獻(xiàn)血者（HDs）外周血中NPA的鑒定

????????使用ImageStreamX（ISX）成像流式細(xì)胞儀，NPAs從NSCLC患者和HDs的全血中被鑒定為CD15+ CD14-中性粒細(xì)胞，其血小板糖蛋白4（CD36）和整合素α-IIb（ITGA2B，也稱為CD41a）雙重陽(yáng)性（圖1A，B）。此外，發(fā)現(xiàn)來(lái)自NPAs的CD36+和ITGA2B+血小板也表達(dá)P-選擇素（CD62P）（圖1B）。還可以通過(guò)May-Grünwald-Giemsa染色在未處理的NSCLC患者的全血涂片中輕松識(shí)別NPAs（圖1C）。由于NPAs的頻率被證明在各種病癥患者的血液中比HDs要高，作者接下來(lái)通過(guò)ISX量化了NSCLC患者和HDs之間中性粒細(xì)胞中NPAs的頻率。雖然NSCLC患者和HDs之間的NPA頻率大致相同沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異，但與NSCLC患者和HDs的NPA平均頻率相比，一名NSCLC患者顯示出超過(guò)3倍的NPA比例（圖1D）。有趣的是，在分析的所有六名NSCLC患者中，這名NPA比例高的患者也顯示出迄今為止最高的NLR值，主要是由較高的中性粒細(xì)胞絕對(duì)數(shù)和最高的腫瘤負(fù)擔(dān)。

圖1????在 NSCLC 患者和健康供體的外周血中鑒定 NPA。

2.血小板優(yōu)先與癌癥患者血液中的低密度中性粒細(xì)胞（LDN）結(jié)合，而不是正常密度中性粒細(xì)胞（NDN）

????????分析LDN和NPA之間的潛在聯(lián)系后發(fā)現(xiàn)：與HDs相比LDN在癌癥患者血液中的含量更高（圖2A）。對(duì)NSCLC和頭頸癌（HNC）患者血液中大量LDN和NDN的公開(kāi)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（GSE79404）進(jìn)行了單樣本基因集富集分析（ssGSEA）發(fā)現(xiàn)：已發(fā)表的血小板特異性基因標(biāo)記“Raghavachari”在LDN中的富集程度顯著高于NDN（圖2B）。接下來(lái)分離LDN和NDN，使用ISX流式細(xì)胞儀發(fā)現(xiàn)CD15+CD14-CD36+ITGA2B+CD62P+NPAs來(lái)自LDN而非NDN（圖2C,D）。NPA約占LDN的2%，但在NDN人群中可忽略不計(jì)（圖2C-E）。

綜上所述，表明血小板優(yōu)先與LDN結(jié)合，而不是NDN。

圖2????NPA定義了NDN中沒(méi)有的LDN子集

3.公共scRNA-seq數(shù)據(jù)集中NSCLC患者和HDs的全血白細(xì)胞NPA的鑒定

（1）NSCLC患者數(shù)據(jù)集【GSE127465】：在分析中使用了標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)數(shù)表，并保留了原有的主要細(xì)胞類型注釋，以確定血細(xì)胞群。重新分類所有白細(xì)胞（圖3A）并區(qū)分六個(gè)中性粒細(xì)胞簇（命名為Neu 1、Neu 2、Neu 3、Neu 4、Neu 5和Neu 6），Neu 5簇與其他中性粒細(xì)胞簇不同，與血小板簇非常接近 （圖3B）。發(fā)現(xiàn)通過(guò)MCP的方法計(jì)算的關(guān)于‘house 11 genes’評(píng)分，中性粒細(xì)胞顯著高于血小板、單核細(xì)胞、B細(xì)胞/pDC，T細(xì)胞和NK細(xì)胞（圖3C）；然后評(píng)估了已發(fā)表的血小板特異性基因標(biāo)記“Raghavachari”在所有已識(shí)別聚類中的ssGSEA富集分?jǐn)?shù)，與中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、B細(xì)胞/pDC、T細(xì)胞和NK細(xì)胞相比，血小板簇是血小板特異性基因特征最豐富的細(xì)胞類型（圖3D），兩步實(shí)驗(yàn)都驗(yàn)證了標(biāo)記的特異性。中性粒細(xì)胞特異性基因（CSF3R、CXCR2和FCGR3B）在所有六個(gè)中性粒細(xì)胞簇中的表達(dá)水平最高，包括Neu 5簇（圖3E）。從基因水平來(lái)看，PF4、PPBP和NRGN這三個(gè)血小板基因是差異較大的上調(diào)基因，能夠區(qū)分Neu 5簇與其他中性粒細(xì)胞簇和免疫細(xì)胞簇（圖3F）。總之，表達(dá)血小板基因的中性粒細(xì)胞Neu 5簇似乎與NPA相對(duì)應(yīng)。

圖3????在NSCLC患者外周血白細(xì)胞的公共scRNAseq數(shù)據(jù)中鑒定表達(dá)血小板基因的中性粒細(xì)胞簇。

????????為了驗(yàn)證這個(gè)含有NPA的表達(dá)血小板基因的中性粒細(xì)胞Neu 5簇不是這個(gè)特定的scRNAseq數(shù)據(jù)集所獨(dú)有的，作者研究了HDs全血白細(xì)胞（GSE145230）的公共scRNAseq數(shù)據(jù)集中是否存在表達(dá)血小板基因的中性粒細(xì)胞。

（2）HDs數(shù)據(jù)集【GSE145230】：通過(guò)進(jìn)行與NSCLC患者scRNAseq數(shù)據(jù)集（GSE127465）相同的分析，能夠識(shí)別位于血小板簇和其他中性粒細(xì)胞簇之間的一個(gè)中性粒細(xì)胞簇（Neu 17）（圖S1A，B）。與血小板、單核細(xì)胞、B 細(xì)胞/pDC、T細(xì)胞和NK細(xì)胞相比，中性粒細(xì)胞特異性基因特征“in house 11 genes”再次被證明對(duì)中性粒細(xì)胞具有特異性（圖S1C）。血小板特異性基因標(biāo)記“Raghavachari”也是如此，其在血小板簇中的平均ssGSEA得分顯著高于中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、B細(xì)胞/pDC、T細(xì)胞和NK細(xì)胞（圖S1D）。與之前在NSCLC患者的scRNAseq數(shù)據(jù)集中發(fā)現(xiàn)的一致，部分Neu 17細(xì)胞表達(dá)高水平的中性粒細(xì)胞特異性基因（圖S1E）和血小板特異性基因（圖S1F），這表明表達(dá)血小板基因的中性粒細(xì)胞的鑒定可推廣到任何人類的全血scRNAseq數(shù)據(jù)集。

圖S1? ? 在HDs外周血白細(xì)胞的公共scRNAseq數(shù)據(jù)中鑒定表達(dá)血小板基因的中性粒細(xì)胞簇。

? ? ? 為了排除中性粒細(xì)胞中血小板基因的上調(diào)不是中性粒細(xì)胞活化的結(jié)果，作者測(cè)試了血小板特異性基因特征“Raghavachari”的富集是否在中性粒細(xì)胞活化時(shí)增加。使用了來(lái)自膿毒癥患者的 GM-CSF 或血漿體外激活的中性粒細(xì)胞的公共轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（GSE15139和GSE49757）。與對(duì)照相比，中性粒細(xì)胞中血小板特征的富集評(píng)分在激活時(shí)沒(méi)有顯著差異。

????????因此，Neu 5 (GSE127465) 或 Neu 17 (GSE145230) 簇中血小板基因的表達(dá)似乎不是由中性粒細(xì)胞活化引起的。 總的來(lái)說(shuō)，這些結(jié)果強(qiáng)烈表明：Neu 5 和/或 Neu 17 中性粒細(xì)胞簇展現(xiàn)出血小板基因的高表達(dá)，很可能含有NPAs。

4.NPA中性粒細(xì)胞基因特征顯示脫顆粒、趨化性和跨內(nèi)皮遷移能力增強(qiáng)

? ? ? ? 為了在mRNA水平上更深入地研究非小細(xì)胞肺癌患者全血白細(xì)胞NPAs的特征，作者重點(diǎn)分析了非小細(xì)胞肺癌患者的scRNAseq數(shù)據(jù)集（GSE127465）。Neu 5簇中只有一小部分細(xì)胞表達(dá)血小板特異性基因（PF4、PPBP和NRGN）（圖3F）。基于視覺(jué)細(xì)胞離散度，Neu 5簇比其他中性粒細(xì)胞簇更不均勻（圖4A）。從整個(gè)Neu 5簇的437個(gè)細(xì)胞中選擇了48個(gè)共表達(dá)三種血小板特異性基因（PF4、PPBP和NRGN）的細(xì)胞，命名為“Neu 5 PPBPhigh PF4high NRGNhigh”（圖4A）。為了進(jìn)一步確定NPA群中的中性粒細(xì)胞是否不同于任何其他中性粒細(xì)胞亞群，首先將NPA群（Neu 5 PPBPhigh PF4high NRGNhigh細(xì)胞）與每個(gè)中性粒細(xì)胞簇分別進(jìn)行差異基因表達(dá)分析（圖4B）。然后從每個(gè)成對(duì)的比較中獲得NPA簇中上調(diào)基因的集合，共有191個(gè)基因。然后去除血小板基因（圖4C），并確定了120個(gè)非血小板基因，這些非血小板基因可將NPA相關(guān)中性粒細(xì)胞與任何其他中性粒細(xì)胞亞群區(qū)分開(kāi)來(lái)。

????????接下來(lái)進(jìn)行GO和KEGG分析，發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞脫顆粒/趨化相關(guān)生物過(guò)程、分泌顆粒相關(guān)細(xì)胞成分和跨內(nèi)皮遷移相關(guān)KEGG基因集顯著富集（圖4D）。總的來(lái)說(shuō)，這些數(shù)據(jù)表明NPAs相關(guān)的中性粒細(xì)胞顯示出增強(qiáng)的脫顆粒、趨化性和跨內(nèi)皮遷移功能。

圖4????與其他中性粒細(xì)胞亞群相比，NPA基因特征在中性粒細(xì)胞脫顆粒、趨化性和跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移GO術(shù)語(yǔ)方面更為豐富。

5.在胰腺癌和肝細(xì)胞癌患者中，特異性NPAs相關(guān)的中性粒細(xì)胞特征與較差的預(yù)后相關(guān)

????????接下來(lái)作者討論了NPA相關(guān)中性粒細(xì)胞在不同腫瘤類型中的預(yù)后意義。第一步是產(chǎn)生特定的NPA相關(guān)中性粒細(xì)胞特征，排除其他非中性粒血液免疫細(xì)胞類型和在血小板中表達(dá)的任何其他基因（圖5A），得到16個(gè)非血小板NPA相關(guān)中性粒細(xì)胞特異性基因（圖5B）。使用人類NSCLC腫瘤樣本的scRNAseq數(shù)據(jù)與之前使用的患者全血相匹配，隨后排除了被多種其他腫瘤相關(guān)細(xì)胞類型高度表達(dá)的RBPJ、IDH2、HELLPAR和CCNI，從而產(chǎn)生最終12個(gè)NPAs相關(guān)的中性粒細(xì)胞特征基因（圖5B）。接下來(lái)在發(fā)現(xiàn)集中驗(yàn)證了這個(gè)新的NPAs相關(guān)中性粒細(xì)胞特征的特異性，顯示在12個(gè)基因的NPA相關(guān)中性粒細(xì)胞特征中至少有3個(gè)共同表達(dá)的細(xì)胞在腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞中的富集程度明顯高于腫瘤微環(huán)境中存在的任何其他主要細(xì)胞類型（圖5C）。

????????作者用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的泛癌方法評(píng)估了12個(gè)中性粒細(xì)胞特征相關(guān)基因的預(yù)后價(jià)值（圖5B）。為了進(jìn)行比較還使用了中性粒細(xì)胞特征“in house 11 genes”來(lái)探究常規(guī)中性粒細(xì)胞的預(yù)后價(jià)值，在兩個(gè)獨(dú)立的scRNAseq數(shù)據(jù)集中證明了中性粒細(xì)胞的高度特異性（圖5C）。通過(guò)進(jìn)行多變量Cox分析，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)NPAs相關(guān)中性粒細(xì)胞特征與各種類型的NSCLC癌癥患者、肺鱗狀細(xì)胞癌（LUSC）和肺腺癌（LUAD）的預(yù)后之間存在任何關(guān)聯(lián)（圖5D）。然而，該特征與胰腺癌患者(PAAD)以及肝細(xì)胞癌患者 (LIHC) 的更差的無(wú)進(jìn)展間隔期（PFI）和總生存期（OS）具有統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性（圖5D )。

圖5????在胰腺癌和肝細(xì)胞癌患者中，特異性NPA基因特征與較差的預(yù)后相關(guān)。

????????典型的中性粒細(xì)胞特征“in house 11 genes”無(wú)法概括 PAAD 和 LIHC 中如此重要的預(yù)后價(jià)值，更強(qiáng)化了NPA 相關(guān)中性粒細(xì)胞是具有不同臨床結(jié)果的獨(dú)特中性粒細(xì)胞群體的觀點(diǎn)（圖5D）。Kaplan-Meier 單變量分析還顯示 PAAD（圖 5E）和 LIHC 癌癥患者（圖 5F）中 NPA 相關(guān)的中性粒細(xì)胞特征的12個(gè)基因 的預(yù)后價(jià)值較差。典型的中性粒細(xì)胞特征“in house 11 genes”在PAAD癌癥患者（圖5E）和LIHC癌癥患者（圖5F）中均未顯示與預(yù)后有任何統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著關(guān)聯(lián)。這再次表明NPA相關(guān)中性粒細(xì)胞不同于典型的中性粒細(xì)胞。總而言之，腫瘤中存在的與NPA相關(guān)中性粒細(xì)胞所對(duì)應(yīng)的中性粒細(xì)胞亞群可能對(duì)PAAD和LIHC癌癥患者有不利影響。

四、結(jié)論

? ? ? ? 作者的研究首次報(bào)告了基于人類全血白細(xì)胞scRNA序列數(shù)據(jù)在轉(zhuǎn)錄組水平上對(duì)NPA的鑒定和表征?；谵D(zhuǎn)錄組學(xué)特征，發(fā)現(xiàn)與NPA結(jié)合的中性粒細(xì)胞表現(xiàn)出增強(qiáng)的脫顆粒、趨化性和跨內(nèi)皮遷移特征，它們將更有效地浸潤(rùn)腫瘤，然后促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。研究結(jié)果表明，來(lái)自NPA的中性粒細(xì)胞代表與LDN相關(guān)的中性粒細(xì)胞的一個(gè)獨(dú)特子集。最后，利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)特異性NPA相關(guān)中性粒細(xì)胞特征與PAAD和LIHC患者的預(yù)后較差相關(guān)。因此，NPAs作為一種新的非侵入性血液預(yù)后生物標(biāo)志物，在實(shí)體瘤癌癥患者中具有臨床應(yīng)用價(jià)值。