發(fā)生污染，既耽誤時間又是一個災難，熟練的無菌操作能避免許多問題，但早期檢測污染是一種可以預警的方法。對于培養(yǎng)箱中的每瓶細胞都要注意觀察，要養(yǎng)成習慣，每次打開培養(yǎng)箱時，迅速看看有沒有發(fā)生污染。

細菌、酵母、真菌、霉菌、支原體以及其他的培養(yǎng)細胞都可能引起污染。

怎樣識別污染

一、肉眼觀察，把培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿拿起來，對著光線檢查。

渾濁情況。即使細胞密度很高，培養(yǎng)基也應該是透明的。輕輕移動或晃動培養(yǎng)瓶，觀察培養(yǎng)基的渾濁或懸浮情況，一些霉菌可能會在培養(yǎng)基的表面形成菌落。

培養(yǎng)基顏色的變化。酸性條件下，加了酚紅的培養(yǎng)基會由紅變黃，而堿性條件下會變成紅紫色。細菌污染常常會使培養(yǎng)基變成黃色，真菌污染會使培養(yǎng)基變成深紫紅色。

聞！當然不能打開瓶子去聞，把鼻子貼在瓶口聞，許多污染發(fā)生以后都會散發(fā)出易察覺的、特殊的氣味，甚至一打開培養(yǎng)箱門就聞到了。

二、顯微觀察。在倒置顯微鏡下，先用低倍(10 X) 再用高倍(40 X) 物鏡（總放大倍數(shù)為400) 觀察細胞培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中的細胞：

其他有機體。在低倍鏡下，真菌的菌絲體成長棒狀，并橫穿整個視野，還可以觀察到酵母，有時呈小圓球形，有時還有芽。

在高倍鏡下可以觀察到細菌，它們可能是棒狀或球狀，單獨成鏈或成團存在，它們也可能和細胞混在一起，并且明顯處于細胞內(nèi)部，有些細胞可能已經(jīng)裂解變得模糊。觀察時可能每兩個視野才出現(xiàn)一個污染（當然也算被污染了！），而且可能污染物是可以運動的。

損傷細胞。感染會殺死細胞，可能導致每個細胞都裂解和／或細胞層從附著物上完全剝離，更可能的是細胞變得不規(guī)則（或大或小），在低倍鏡下是黑色的粒狀

懸浮培養(yǎng)細胞比貼壁培養(yǎng)細胞更加難以顯微觀察，尤其是高倍顯微鏡下。

將培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿放在顯微鏡的載物臺上，靜置一會。

將焦距對準器皿的底部，觀察那些輕微附著的細胞，因為它們可能已經(jīng)接觸到了微生物。

對準整個培養(yǎng)瓶焦距，當發(fā)現(xiàn)細胞的時候，用細聚焦調(diào)節(jié)旋鈕調(diào)節(jié)，仔細檢查周圍的培養(yǎng)基有沒有污染發(fā)生。

圖一 倒置顯微鏡放大倍數(shù)400 倍下觀察到的貼壁細胞被污染的情況

a 霉菌； b 酵母； c 細菌，小的棒狀； d 細菌，成團的球狀，有些細菌已經(jīng)進入細胞內(nèi)部。

如果你不能確定是否發(fā)生了污染

制作濕涂片或染色片。取1 ml 培養(yǎng)基離心，用50 μl 培養(yǎng)基或緩沖液重新懸浮細胞，滴一滴到載玻片，蓋上蓋玻片制成濕涂片；或涂片、固定并染色（甲基蘭或革蘭氏染液），在高倍鏡下觀察。

將細胞在營養(yǎng)培養(yǎng)基或瓊脂培養(yǎng)基上劃線， 37℃培養(yǎng)3 天。如果有菌落，那么細胞被污染了。

取1 ml 的細胞培養(yǎng)液至無菌的微量離心管中， 37℃培養(yǎng)3 天。觀察到渾濁物，做濕涂片顯微鏡觀察。