文獻(xiàn)信息
標(biāo)題：Transcriptomic Features in a Single Extracellular Vesicle via Single-Cell RNA Sequencing
日期及雜志：2022 Nov, Small Methods
作者及單位：Tao Luo, Si-Yi Chen, Zhi-Xin Qiu, Ya-Ru Miao, Yue Ding, Xiang-Yu Pan, Yirong Li, Qian Lei,* and An-Yuan Guo*, Department of Laboratory Medicine Zhongnan Hospital of Wuhan University
文獻(xiàn)概述(這篇文獻(xiàn)的結(jié)論是什么？)
盡管許多研究已經(jīng)研究了細(xì)胞外囊泡(EV)中的功能分子，但單個(gè)EV中核糖核酸分子的確切數(shù)量尚不清楚。因此，在單個(gè)EV水平上探索轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征和異質(zhì)性至關(guān)重要。在這里，使用10x基因組學(xué)平臺(tái)，對(duì)來自人類K562和間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）的單個(gè)EV的RNA進(jìn)行了分析。關(guān)鍵步驟是使用calcein-AM標(biāo)記完整的EV，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)EV濃度，并使用具有自適應(yīng)閾值的CB2算法有效區(qū)分真實(shí)EV和背景。單個(gè)EV包含的基因數(shù)為6 ~ 148個(gè)，平均為52個(gè)。核糖體基因、線粒體基因和真核翻譯延伸因子1α在所有EV樣品中具有較高的占比。血紅蛋白基因在k562 - EV中高表達(dá)，而細(xì)胞骨架基因在MSC - EV中富集。在單個(gè)EV數(shù)據(jù)集中，10個(gè)或更多具有不同marker基因的集群顯示出EV異質(zhì)性。此外，將EV及其親本細(xì)胞整合在一起，可以同時(shí)發(fā)現(xiàn)每個(gè)簇中的EV和細(xì)胞，表明各種EV的細(xì)胞來源不同。據(jù)作者所知，這項(xiàng)研究提供了第一個(gè)單EV水平的高通量轉(zhuǎn)錄組，并提高了對(duì)EV的理解。
文獻(xiàn)結(jié)果(每個(gè)結(jié)果的圖片詳細(xì)解讀)
1、表征及濃度分析
通過連續(xù)差異離心分離出來自K562和MSC細(xì)胞的EV。如（圖1a）所示，通過透射電鏡觀察到具有膜狀結(jié)構(gòu)的球形囊泡。NTA分析證實(shí)，EV的粒徑分布在直徑范圍為100-1000nm之間，其中大部分在100-200nm范圍內(nèi)（圖1b）。通過EV標(biāo)記物的表達(dá)來驗(yàn)證EV，包括跨膜蛋白（CD9）、胞質(zhì)蛋白（Alix和TSG101）和微囊泡特異性marker蛋白AnnexinA1（圖1c）。使用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量EV濃度，用100、300、500和1000 nm的校準(zhǔn)珠定義EV門控策略（圖1d）。在P6 gate處記錄K562-EV和MSC-EV樣品的calcein-AM陽(yáng)性事件濃度(圖1e,f)。
2、從10x Genomics數(shù)據(jù)中鑒定出單個(gè)EV
為了發(fā)現(xiàn)單個(gè)EV的轉(zhuǎn)錄組特征，基于10x Genomics平臺(tái)對(duì)3個(gè)EV樣本（K562-EV1、K562-EV2和MSC-EV）進(jìn)行scRNA-seq檢測(cè)。（圖2a）在去除背景條形碼、識(shí)別異常值和去除雙重序列后，三個(gè)原始的10x Genomics輸出數(shù)據(jù)集用于下游分析。（圖2b,c）分別顯示了原始基因條形碼矩陣和從每個(gè)數(shù)據(jù)集中去除背景條形碼的過濾矩陣的Barcode rank plot。（圖2b）中Barcode rank plot形狀上的拐點(diǎn)通常用于區(qū)分與細(xì)胞相關(guān)的條形碼和背景條形碼，然而EV通常比細(xì)胞小，在本研究中的EV Barcode rank plot中沒有明確的拐點(diǎn)。因此，在0x Genomics平臺(tái)上的Cell Ranger上的cell-calling算法不能將EV與背景區(qū)分開來，因?yàn)槊總€(gè)EV的RNA含量較低。CB2算法通過將條形碼根據(jù)其總唯一分子標(biāo)識(shí)符（UMI）計(jì)數(shù)分為上閾值和下閾值來解決這個(gè)cell-calling問題。去除背景條形碼后，（圖2c）有了清晰的拐點(diǎn)。（圖2d）柱狀圖顯示了不同EV樣本的EV數(shù)量和檢測(cè)到的基因總數(shù)(左)，以及每個(gè)EV中基因數(shù)量和UMI計(jì)數(shù)的中位數(shù)(右)。（圖2e,f）分別顯示了檢測(cè)到的基因分布和每個(gè)數(shù)據(jù)集中的UMI計(jì)數(shù)的頻率直方圖。
3、EV樣本中的高表達(dá)基因
接下來，本研究調(diào)查了每個(gè)EV數(shù)據(jù)集中的前500個(gè)高表達(dá)基因。3個(gè)EV樣本共有323個(gè)共有基因，其中包含78個(gè)（24.1%）核糖體基因和8個(gè)（MT-ATP6、MT-CO1/2/3、MT-CYB和MT-ND1/3/4）線粒體基因（圖3a）。此外，本研究比較了在單EV和bulk-EV RNA-seq數(shù)據(jù)中表達(dá)量最高的前500個(gè)基因，以驗(yàn)證單EV集的可靠性，發(fā)現(xiàn)有229個(gè)基因在所有5個(gè)數(shù)據(jù)集中都有高表達(dá)，其中包括76個(gè)（33.2%）核糖體基因和7個(gè)線粒體基因（圖3b）。結(jié)果表明，單EV測(cè)序數(shù)據(jù)的可靠性，與bulk-EV RNA-seq數(shù)據(jù)具有可比性。接下來，還研究了每個(gè)數(shù)據(jù)集中基因表達(dá)百分比最高的前10個(gè)基因（檢測(cè)到的EV數(shù)量除以EV總數(shù)）（圖3c）。
4、單EV轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性
為了探索單個(gè)EV的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性，采用非線性降維策略t-SNE和無監(jiān)督聚類對(duì)單EV測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析。使用Harmony包對(duì)K562-EV1和K562-EV2數(shù)據(jù)集進(jìn)行去批次效應(yīng)，然后確定了12個(gè)聚類（圖4a，b）。在MSC-EV數(shù)據(jù)集中確定了10個(gè)聚類（圖4c）。同時(shí)，使用Seurat軟件包中的FindAllMarkers功能來表征每個(gè)EV簇中的marker基因。在整合的K562-EV數(shù)據(jù)集中，cluster0的EV數(shù)量最多（≈為28.9%），但沒有顯著的marker基因，在cluster1和cluster2中分別檢測(cè)到1個(gè)和2個(gè)核糖體marker基因，cluster6和cluster11的標(biāo)記基因均為線粒體基因，cluster8的標(biāo)記基因均為血紅蛋白基因（圖4d）。在MSC-EV數(shù)據(jù)集中，cluster7中的marker基因?yàn)榫€粒體基因（圖4e）。
5、EV與親本細(xì)胞整合的轉(zhuǎn)錄譜
為了比較EV與其親本細(xì)胞的表達(dá)，將單個(gè)EV數(shù)據(jù)集與親本細(xì)胞的單細(xì)胞數(shù)據(jù)集整合，進(jìn)行進(jìn)一步分析。結(jié)果表明，每個(gè)cluster既有EV，也有細(xì)胞，表明不同的EV來源于不同的細(xì)胞。在所有三個(gè)K562數(shù)據(jù)集(K562- EV1, K562- EV2和K562)中，識(shí)別出9個(gè)不同的cluster(圖5a，b)。cluster1中的marker基因主要為血紅蛋白基因，cluster2中的marker基因主要為線粒體基因(圖5e)。此外，在MSC- EV和MSC集成數(shù)據(jù)集中鑒定了12個(gè)cluster（圖5c），并且MSC- EV中的單個(gè)EV分散在MSC中。在MSC- EV和MSC集成數(shù)據(jù)集中檢測(cè)到的marker基因如（圖5f）所示，包括許多細(xì)胞骨架基因，如微管蛋白基因(TUBA1A/B/C和TUBB4B)和肌動(dòng)蛋白基因(ACTA2/G2)。
文獻(xiàn)方法(使用的生物信息學(xué)方法)
單EV降維和無監(jiān)督聚類：主成分分析（PCA）使用默認(rèn)設(shè)置的前1000個(gè)高變異基因進(jìn)行。利用前10個(gè)主成分，將EV聚類，通過FindNeighbors和FindClusters函數(shù)在Seurat中構(gòu)建共享最近鄰（SNN）圖?？梢暬峭ㄟ^具有相同主成分的t-SNE降維策略進(jìn)行的。
EV數(shù)據(jù)集整合：使用harmony（v 0.1.0）軟件包來校正批次效應(yīng)，以整合EV數(shù)據(jù)集。首先，運(yùn)行SCTransform函數(shù)分別對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行歸一化，得出檢測(cè)到的基因數(shù)量。此外，利用SelectIntegrationFeatures函數(shù)來確定PCA算法所需的前1000個(gè)高變異基因。然后，使用r中的merge函數(shù)對(duì)所有數(shù)據(jù)集進(jìn)行合并。最后，使用RunHarmony函數(shù)將SCT分析數(shù)據(jù)與前50個(gè)主成分進(jìn)行整合。
EV數(shù)據(jù)集中聚類的差異基因表達(dá)分析：使用基于Wilcoxon秩和檢驗(yàn)的Seurat FindAllMarkers函數(shù)對(duì)每個(gè)聚類中的marker基因進(jìn)行鑒定。通過將logFC設(shè)置為0.15來確定每個(gè)cluster的特征基因。
GO富集分析： GO富集分析是對(duì)每個(gè)數(shù)據(jù)集中特異性表達(dá)的基因進(jìn)行Fisher精確檢驗(yàn)。該過程使用clusterProfiler（v 4.2.2）。顯著富集的閾值為p值< 0.01和q值< 0.05。
文章亮點(diǎn)(這篇文獻(xiàn)的優(yōu)點(diǎn)在哪？)
- 本研究首次揭示了單個(gè)EV中的基因數(shù)量，并確定了同一細(xì)胞群中個(gè)體EV的異質(zhì)性。
我的疑問(這篇文獻(xiàn)的不足在哪？)
在本研究中，完整的EV被定義為Calcein-AM陽(yáng)性事件。Calcein-AM在被動(dòng)進(jìn)入EV之前不熒光，然后被囊泡內(nèi)酯酶激活，成為熒光和EV無關(guān)，這對(duì)EV定量有一定的影響。
由于10x Genomics平臺(tái)的局限性，基于液滴的單細(xì)胞平臺(tái)中的每個(gè)液滴都可能包含環(huán)境RNA。特別是，環(huán)境RNA可能對(duì)低RNA含量的條形碼有顯著的影響。
在本研究中，重點(diǎn)研究了具有蛋白質(zhì)編碼功能的mRNA，其他RNA仍有待于其他方法的進(jìn)一步研究。
和我相關(guān)(我從這篇文獻(xiàn)里學(xué)到了什么？)
- CB2算法將條形碼根據(jù)其總UMI計(jì)數(shù)分為上閾值和下閾值?？俇MI計(jì)數(shù)高于上閾值的條形碼被定義為真實(shí)的EV?？傆?jì)數(shù)低于較低閾值的條形碼被定義為背景條形碼，并用于估計(jì)背景分布。剩下的條形碼被分成幾組。然后，CB2算法根據(jù)估計(jì)的背景分布對(duì)每個(gè)聚類組進(jìn)行測(cè)試。利用期望最大化算法和高斯混合模型獲得了運(yùn)行CB2算法的自適應(yīng)上、下閾值。利用自適應(yīng)的上下閾值等默認(rèn)參數(shù)，通過應(yīng)用CB2算法消除了背景條形碼。
相關(guān)文獻(xiàn)(文獻(xiàn)擴(kuò)展，其他補(bǔ)充資料)
1.https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-020-02054-8
