Cancer cell | 單細(xì)胞測序檢測揭示CAR-T脫靶效應(yīng)

原創(chuàng)?驕陽似我?圖靈基因?今天

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撰文：驕陽似我

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嵌合抗原受體（CAR）工程細(xì)胞療法，利用轉(zhuǎn)基因免疫細(xì)胞產(chǎn)生定制的免疫反應(yīng)，已經(jīng)徹底改變了癌癥治療。近年來，CAR工程細(xì)胞療法臨床試驗的數(shù)量、類型和適應(yīng)癥迅速增加。然而，嚴(yán)重且可能危及生命的毒性仍然是CAR工程細(xì)胞療法的主要限制，如靶向、非腫瘤效應(yīng)。本文通過分析來自人類蛋白質(zhì)圖譜和基因型組織表達(dá)項目的多個組織的大量表達(dá)數(shù)據(jù)，研究如何避免脫靶效應(yīng)。

近期，在cancer cell雜志上發(fā)表了一篇名為“Expression of chimeric antigen receptor therapy targets detected by single-cell sequencing of normal cells may contribute to off-tumor toxicity”的文章，表明單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）可能提供前所未有的高分辨率表達(dá)譜，使我們能夠根據(jù)罕見細(xì)胞亞群中靶細(xì)胞的表達(dá)來了解CAR治療的有效性和安全性。例如，正常腦組織中的一小部分壁細(xì)胞表達(dá)CD19，并被CD19CAR T細(xì)胞作為靶細(xì)胞，這可能通過增加腦血管通透性導(dǎo)致神經(jīng)毒性。為了更好地理解CAR導(dǎo)向免疫治療的效果，迫切需要對不同正常組織中不同細(xì)胞類型中不同CAR靶點的表達(dá)進(jìn)行系統(tǒng)的單細(xì)胞水平解剖。

本文在兩個獨立的單細(xì)胞隊列中分析了591個CAR靶點的表達(dá)，包括截至2021年1月的臨床試驗中使用的71個和預(yù)測具有良好安全性的520個，包括基于Microwell-seq的人類細(xì)胞景觀（HCL）中的342755個成體細(xì)胞scRNA-seq數(shù)據(jù)以及基于103基因組學(xué)的成人細(xì)胞圖譜（AHCA）中的84363個成人細(xì)胞scRNA序列數(shù)據(jù)。最近的一項研究發(fā)現(xiàn)，人腦中7906個細(xì)胞（0.15%）中只有12個CD19可測量的壁細(xì)胞可能會導(dǎo)致潛在毒性，因此本文使用了更嚴(yán)格的截止值，將CAR靶點定義為潛在危險基因（PRG）如果在100多個非免疫細(xì)胞和至少三個正常組織中超過2%的總細(xì)胞中可測量到。通過采用該標(biāo)準(zhǔn)，分別從HCL和AHCA中識別出92和88個PRG，并且HCL和AHCA數(shù)據(jù)集中共有57個PRG；這一結(jié)果表明本文的分析是可靠的。圖1：研究抗CD19 CAR-T細(xì)胞試驗中的嚴(yán)重神經(jīng)事件。

本文分別鑒定了132個和147個PRG，其中100個為非免疫細(xì)胞，占總細(xì)胞的1%，100個為非免疫細(xì)胞，占總細(xì)胞的0.5%。所以考慮到靈活性，允許選擇不同的截止值。值得注意的是，CD19和BCMA（也稱為TNFRSF17）是經(jīng)批準(zhǔn)的CART細(xì)胞療法用于治療血液系統(tǒng)癌癥的兩個靶基因，在本文的單細(xì)胞分析和之前的大量表達(dá)數(shù)據(jù)分析中顯示出相對有限的表達(dá)模式。鑒于scRNA-seq能夠解剖罕見的細(xì)胞群和/或類型，能夠識別出幾個PRG，包括EGFR、PSCA和KDR（VEGFR2），它們在特定組織中高于閾值，而該組織尚未通過批量表達(dá)分析識別出相關(guān)組織。EGFR是在多個臨床試驗（例如NCT02331693和NCT03182816）中研究的CAR靶點，在包括胃在內(nèi)的多個組織中表達(dá)（307個可測量細(xì)胞，占胃總細(xì)胞的2.2%，包括基質(zhì)細(xì)胞、杯狀細(xì)胞和胃主細(xì)胞），盡管EGFR在胃組織中的風(fēng)險表達(dá)模式尚未通過大量分析確定。EGFR-CART細(xì)胞治療的一期臨床試驗（NCT01869166）報告了EGFR陽性膽管癌和轉(zhuǎn)移性胰腺癌患者的胃腸道不良事件，這與本文的單細(xì)胞分析結(jié)果一致。KDR是NCT01218867中研究的CAR靶點，由于在多個組織中的單細(xì)胞水平表達(dá)，包括肝臟（455個可測量細(xì)胞，占肝臟總細(xì)胞的4.3%），其通過大量數(shù)據(jù)分析確定為未檢測到或低表達(dá)，因此存在潛在風(fēng)險。圖2：不同潛在危險基因（PRG）的組織和類型。

最近的研究開發(fā)了邏輯“和”開關(guān)，以實現(xiàn)更復(fù)雜的CARs結(jié)構(gòu)，從而增加工程細(xì)胞的激活并將毒性降至最低。本文構(gòu)建了一個由320884個風(fēng)險較小的邏輯“和”設(shè)計基因?qū)M成的預(yù)定義列表的單細(xì)胞級安全景觀。將基因?qū)Χx為潛在風(fēng)險對（PRPs）如果兩個基因在100多個非免疫細(xì)胞中同時可測量，并且至少在一個組織中占細(xì)胞總數(shù)的2%以上。從HCL分析中確定了2972個PRPs，從AHCA分析中確定了8895個PRPs，兩個數(shù)據(jù)集共享了1509個PRPs。其中，一些PRP至少包括一個PRG。EGFR-APP和EGFREC61G被鑒定為廣泛表達(dá)在HCL和AHCA中的氣管、甲狀腺、胸膜、宮頸和動脈細(xì)胞中。大多數(shù)PRP不包含PRG，如APP-CD63，可在38183個細(xì)胞（占HCL總細(xì)胞的11.1%）中檢測到，在HCL中擴(kuò)展到28個組織中的22種不同細(xì)胞類型，在AHCA中擴(kuò)展到20478個細(xì)胞（占AHCA總細(xì)胞的5.9%），在AHCA中擴(kuò)展到11個組織中的14種不同細(xì)胞類型。圖3：基于HCL分析，比較不同截止值確定的潛在危險基因（PRG）數(shù)量。

為了幫助研究界設(shè)計CAR目標(biāo)，本文開發(fā)了一個友好的數(shù)據(jù)門戶，單細(xì)胞水平的CAR靶基因毒性（CARTSC）（https://hanlab.tamhsc.edu/CARTSC/），以便在單細(xì)胞級別瀏覽和搜索單個目標(biāo)以及邏輯“and”設(shè)計開關(guān)表達(dá)式。用戶還可以檢查免疫細(xì)胞和/或組織中所選基因的表達(dá)模式。

這項研究使用單細(xì)胞分析來報告潛在的目標(biāo)，CAR靶向廣泛組織的腫瘤外毒性景觀。隨著來自正常組織的額外的大規(guī)模人類單細(xì)胞組學(xué)數(shù)據(jù)變得可用，靶向的腫瘤外毒性概況的普遍性和準(zhǔn)確性將可能顯著增加。本文的研究并不建議停止基于PRG和/或PRP的臨床試驗。相反，本文建議事先考慮這些目標(biāo)，以規(guī)避目標(biāo)，腫瘤外毒性和密切監(jiān)測，以獲得早期毒性跡象。

本文的研究有幾個局限性。缺乏大規(guī)模的單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)使無法根據(jù)單細(xì)胞分辨率下的蛋白質(zhì)表達(dá)分析CAR靶標(biāo)的潛在毒性。抗原表達(dá)密度是CAR細(xì)胞的重要考慮因素，在本研究中無法表征。此外，scRNAseq中的稀疏表達(dá)模式阻止分析激活劑-抑制劑基因?qū)Φ臐撛诙拘?，其中兩種基因在一種組織中表達(dá)以降低毒性。腫瘤和正常組織中的全面單細(xì)胞多組學(xué)數(shù)據(jù)將為預(yù)測與CAR治療相關(guān)的毒性提供額外的見解。今后將繼續(xù)定期更新本文的數(shù)據(jù)門戶網(wǎng)站，以包括最新的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，將來可以更深入地覆蓋和/或豐富稀有細(xì)胞群。

教授介紹：

金穎

多能干細(xì)胞與發(fā)育生物學(xué)研究組

金穎，研究員，博士生導(dǎo)師。中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所病理生理學(xué)/藥理學(xué)博士，美國北德克薩斯州大學(xué)健康科學(xué)中心Research Associate (1988-1994)，美國德克薩斯大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心Research Fellow (1994-1998)。上海交通大學(xué)特聘教授，上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院特聘教授，中國科學(xué)院上海營養(yǎng)與健康研究所課題組長。上海曙光學(xué)者、中國科學(xué)院“百人計劃”、第二屆百名華僑華人專業(yè)人士杰出創(chuàng)業(yè)獎、上海市優(yōu)秀學(xué)科帶頭人、上海市“三八”紅旗手、上海市領(lǐng)軍人才、上海交通大學(xué)優(yōu)秀共產(chǎn)黨員、中國科學(xué)院?“朱李月華優(yōu)秀教師”和杰出研究員等榮譽(yù)獲得者。主要研究方向為多能干細(xì)胞命運(yùn)決定的分子調(diào)控。先后任J Biol Chem雜志編委，Stem Cell Research and Therapy雜志編委，《上海交通大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版）》編委，《中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志》副主編，國際干細(xì)胞研究學(xué)會（ISSCR）會員、干細(xì)胞研究和臨床轉(zhuǎn)化指南更新任務(wù)組成員（2014年-2016年），上海市細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會理事，中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分會委員，中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會干細(xì)胞生物學(xué)分會副會長等。在Cell Stem Cell、?Cell Res、Dev Cell、J Clin Invest和PNAS等學(xué)術(shù)期刊上發(fā)表通訊作者論文70余篇，先后獲得教育部自然科學(xué)獎二等獎、上海市科學(xué)技術(shù)獎二等獎和三等獎，以及中國干細(xì)胞研究創(chuàng)新獎。

研究方向與進(jìn)展：多年來集中研究多能干細(xì)胞，尤其是人胚胎干細(xì)胞，在體外增殖和分化的調(diào)控機(jī)制，致力于揭示維持胚胎干細(xì)胞無限自我更新的信號通路、轉(zhuǎn)錄因子和表觀遺傳調(diào)控因子等，旨在優(yōu)化人胚胎干細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系。同時，還關(guān)注人胚胎干細(xì)胞如何定向分化為神經(jīng)細(xì)胞，尤其是如何形成神經(jīng)系統(tǒng)不同區(qū)域的神經(jīng)祖細(xì)胞，為獲得臨床疾病治療需要的功能細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

Ying Jing, Yuan Liu, Leng Han et al.Expression of chimeric antigen receptor therapy targetsdetected by single-cell sequencing of normal cells may contribute to off-tumortoxicity[J].?Cancer Cell 39, December 13, 2021.