本文整理通過(guò)原核顯微注射（質(zhì)粒注射）?方法獲得隨機(jī)轉(zhuǎn)基因小鼠的實(shí)驗(yàn)原理、整體流程和純合子鑒定方法。
一、實(shí)驗(yàn)原理
該技術(shù)的核心原理是：將攜帶外源基因（通常構(gòu)建在質(zhì)粒上）的DNA溶液，通過(guò)顯微操作技術(shù)，直接注射到小鼠受精卵的雄原核中（雄原核通常更大、更明顯），然后將存活的受精卵移植到假孕母鼠的輸卵管內(nèi)，使其發(fā)育成個(gè)體。
正常受精是指含有染色體單倍體精子和單倍體卵子，分別攜帶父方與母方的遺傳物質(zhì)，并相互融合組成一個(gè)二倍體細(xì)胞。臨床上，受精的最終判斷是通過(guò)觀察受精后16-18小時(shí)的原核形成界定的，顯微鏡下觀察到卵胞漿內(nèi)出現(xiàn)兩個(gè)原核，即一個(gè)雌原核和一個(gè)雄原核;同時(shí)，卵周隙內(nèi)可見(jiàn)兩個(gè)極體，這樣的受精卵被認(rèn)為正常受精。
隨機(jī)整合：注射的線性化外源DNA片段會(huì)在受精卵早期發(fā)育過(guò)程中，隨機(jī)地整合到小鼠基因組的某個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)上。這種整合是隨機(jī)的，因此被稱(chēng)為“隨機(jī)轉(zhuǎn)基因”。整合通常發(fā)生在染色體復(fù)制之后，可能導(dǎo)致：
多位點(diǎn)整合：外源基因插入到基因組的不同位置。
多拷貝串聯(lián)整合：多個(gè)拷貝頭尾相連地插入到一個(gè)位點(diǎn)。
染色體遺傳：一旦整合成功，這個(gè)外源基因就會(huì)像小鼠自身的基因一樣，隨著染色體進(jìn)行復(fù)制和遺傳。整合發(fā)生在受精卵的單細(xì)胞期，因此發(fā)育成的小鼠的所有體細(xì)胞和生殖細(xì)胞都會(huì)攜帶這個(gè)外源基因，從而可以遺傳給下一代。
表達(dá)與功能研究：通過(guò)設(shè)計(jì)特定的啟動(dòng)子（如廣譜啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子），可以使外源基因在小鼠全身或特定組織細(xì)胞中表達(dá)，進(jìn)而研究該基因的功能、建立人類(lèi)疾病模型或生產(chǎn)特定蛋白質(zhì)。
與ES打靶（基因敲除/敲入）的區(qū)別：此方法不涉及同源重組，不要求定點(diǎn)整合，因此無(wú)法對(duì)內(nèi)源基因進(jìn)行精確修飾，其特點(diǎn)是隨機(jī)、多拷貝、可過(guò)表達(dá)。
二、整體流程
整個(gè)流程耗時(shí)較長(zhǎng)，通常需要6-8個(gè)月甚至更久才能獲得穩(wěn)定的純合子品系。下圖清晰地展示了從準(zhǔn)備到品系建立的完整周期與關(guān)鍵步驟：
第一階段：前期準(zhǔn)備
轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒構(gòu)建：將目的基因cDNA與合適的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止子（如pA尾）等元件克隆到質(zhì)粒中。通常使用微生物質(zhì)粒（如pUC系列）作為骨架。質(zhì)粒需要經(jīng)過(guò)線性化（用限制性?xún)?nèi)切酶切除質(zhì)粒 backbone），以提高整合效率并避免將細(xì)菌序列轉(zhuǎn)入基因組。
DNA制備與純化：對(duì)線性化的DNA片段進(jìn)行純化（如酚氯抽提、乙醇沉淀、柱純化等），并重溶于無(wú)菌的顯微注射緩沖液中。濃度通常調(diào)整到1-5 ng/μL。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物準(zhǔn)備：
供體鼠：選擇品系（如C57BL/6, FVB等），通過(guò)注射孕馬血清促性腺激素（PMSG）和人絨毛膜促性腺激素（hCG）進(jìn)行超數(shù)排卵，獲得大量受精卵。
雄鼠：與供體鼠交配，提供受精卵。
受體鼠（假孕母鼠）：選擇品系（如ICR），與結(jié)扎雄鼠交配，刺激其產(chǎn)生假孕狀態(tài)（有月經(jīng)周期和妊娠反應(yīng)，但無(wú)受精卵），用于接受移植的受精卵。
第二階段：顯微注射與移植
4.?受精卵收集：處死供體鼠，取出輸卵管，收集處于原核期（受精后0.5天）的受精卵。
5.?原核顯微注射：在倒置微分干涉相差（DIC）顯微鏡下，用持卵針固定受精卵，用極細(xì)的玻璃注射針（直徑約1μm）刺入雄原核，將DNA溶液注入，看到原核明顯膨脹即表示注射成功。
6.?胚胎移植：將注射后存活的受精卵（通常培養(yǎng)數(shù)小時(shí)恢復(fù)），移植到假孕母鼠的輸卵管壺腹部或子宮內(nèi)。
第三階段：子代小鼠鑒定與品系建立
7.?子代鼠（F0代）出生與鑒定：假孕母鼠妊娠約20天后產(chǎn)仔，這些第一代小鼠稱(chēng)為Founder（首建鼠）或F0代鼠。
* 在F0代鼠斷奶（約3周齡）時(shí)，采集鼠尾或耳號(hào)組織樣本。
* 提取基因組DNA。
* 通過(guò)PCR（快速初篩）和Southern Blot（金標(biāo)準(zhǔn)，可確認(rèn)整合拷貝數(shù)和位點(diǎn)）鑒定外源基因是否成功整合。Southern Blot尤為重要，因?yàn)椴煌現(xiàn)ounder的整合位點(diǎn)和拷貝數(shù)各不相同，是獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因品系（Line）。
8.?建立轉(zhuǎn)基因品系（Line）：
* 選擇表達(dá)水平高、拷貝數(shù)合適、健康的陽(yáng)性Founder鼠。
* 將Founder鼠與野生型小鼠交配（通常為測(cè)交，即與WT交配），檢測(cè)F1代鼠的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性率。
* 如果Founder的轉(zhuǎn)基因整合在一條染色體上（半合子，Hemizygous），其與WT交配后，F(xiàn)1代陽(yáng)性率應(yīng)約為50%。
* 如果Founder是嵌合體（部分細(xì)胞整合），其F1代陽(yáng)性率可能遠(yuǎn)低于50%，甚至不遺傳。
三、純合子鑒定方法
從Founder建立的轉(zhuǎn)基因品系，其所有后代小鼠都是半合子（只在一號(hào)染色體上整合了轉(zhuǎn)基因）。要獲得純合子，需要將半合子小鼠互交。
原理：純合子（Homozygous）小鼠的兩條同源染色體上都整合了轉(zhuǎn)基因。由于其整合位點(diǎn)和拷貝數(shù)是固定的（對(duì)于某個(gè)特定Line而言），純合子個(gè)體的轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)通常是半合子個(gè)體的2倍。基于這一特征，主要有以下鑒定方法：
實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR / RT-qPCR）?-?最常用、最快捷的方法
原理：設(shè)計(jì)針對(duì)外源轉(zhuǎn)基因的特異性引物和探針，同時(shí)設(shè)計(jì)一對(duì)針對(duì)小鼠內(nèi)參基因（如單拷貝基因Igf2、Gapdh等）的引物和探針作為對(duì)照。
方法：分別檢測(cè)待測(cè)小鼠和已知半合子小鼠的基因組DNA。
結(jié)果判斷：
使用2^(-ΔΔCt)?方法計(jì)算相對(duì)拷貝數(shù)。
若待測(cè)小鼠的轉(zhuǎn)基因信號(hào)強(qiáng)度是半合子小鼠的~2倍，則該小鼠為純合子。
若待測(cè)小鼠的轉(zhuǎn)基因信號(hào)強(qiáng)度與半合子小鼠相近，則該小鼠為半合子。
若無(wú)信號(hào)，則為野生型。
Southern Blot?-?傳統(tǒng)可靠的方法，但操作復(fù)雜
原理：用限制性?xún)?nèi)切酶消化基因組DNA，電泳、轉(zhuǎn)膜后，用標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因片段作為探針進(jìn)行雜交。
結(jié)果判斷：
純合子小鼠的雜交條帶信號(hào)強(qiáng)度應(yīng)是半合子小鼠的2倍（需在曝光線性范圍內(nèi)）。
此方法還能確認(rèn)整合的完整性，但工作量大，不適合快速篩選大量小鼠。
雜交比例分析（Breeding Test）?-?遺傳學(xué)上的“金標(biāo)準(zhǔn)”
原理：將待鑒定的疑似純合子小鼠與野生型小鼠交配。
結(jié)果判斷：
如果待測(cè)鼠是純合子，其所有后代（F1）100%?都應(yīng)為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性（因?yàn)楦改鸽p方都必定傳遞一個(gè)轉(zhuǎn)基因等位基因）。
如果待測(cè)鼠是半合子，其與WT交配的后代陽(yáng)性率應(yīng)約為50%。
優(yōu)點(diǎn)：結(jié)果絕對(duì)準(zhǔn)確。
缺點(diǎn)：耗時(shí)非常長(zhǎng)（需要等一代小鼠出生和成長(zhǎng)），成本高，通常作為最后驗(yàn)證手段或與qPCR方法結(jié)合使用。
表型強(qiáng)度分析（如果適用）
如果外源基因的表達(dá)會(huì)產(chǎn)生可量化且與劑量相關(guān)的強(qiáng)烈表型（如特定蛋白質(zhì)水平、酶活性、生理指標(biāo)等），則可以通過(guò)測(cè)量表型強(qiáng)度來(lái)輔助判斷。
例如，純合子小鼠的蛋白表達(dá)量通常是半合子小鼠的2倍左右。
總結(jié)：常規(guī)流程是先通過(guò)qPCR快速篩選出疑似純合子個(gè)體，然后選取部分疑似個(gè)體通過(guò)雜交比例分析進(jìn)行最終確認(rèn)，從而建立穩(wěn)定的純合子轉(zhuǎn)基因小鼠品系。
