RNA 凝膠是用Northern 印跡的方法來分析RNA 。mRNA 大約只占總RNA 的5% ，在溴化乙錠染色的膠上看不到，因此mRNA 必須用標(biāo)記探針來檢測。

＊樣品制備

RNA 樣品在電泳之前及電泳過程中必須是變性的，否則不能精確測定分子質(zhì)量。變性是由甲醛與甲酰胺來完成的，也可用乙二醛和二甲亞砜或甲基苯（不推薦）。

MOPS 膠的樣品緩沖液： 0.75ml 去離子的甲酰胺，0.15ml 10 x MOPS, 0.24ml 甲醛， 0.1ml 去離子的無RNA酶的水，0.1ml 甘油， 0.08ml 10% (W/V) 澳酚藍(lán)。分裝小管后貯于－ 20℃, 或者每次現(xiàn)配。

加25 μI 樣品緩沖液到5μ1 RNA 樣品?？赡苄枰獫饪sRNA 樣品。

樣品緩沖液中的樣品在65℃ 加熱15min。加1μl mg/ml 溴化乙錠到每個(gè)樣品，混勻。不需要將溴化乙錠加到電泳緩沖液中。

中型大小的膠，加5 ~ 20μg 總RNA, 小型膠加1~5 μg 。

加3 μg mRNA 與加5 ~ 20μg 總RNA 樣相比，會得到更清晰的信號。

＊標(biāo)準(zhǔn)參照物／標(biāo)記參照物

需要標(biāo)準(zhǔn)參照。

許多人利用樣品本身的核糖體RNA作為大致的參照。真核生物核糖體RNA 是28S和18S （大致長5300 和2000 堿基）；原核生物核糖體RNA 是23S 和16S （大腸桿菌大致長3566 與1776 個(gè)堿基） 。

RNA 標(biāo)準(zhǔn)參照有商業(yè)制品。DNA 標(biāo)準(zhǔn)參照在甲醛膠中跑得不太好，不應(yīng)使用。體外RNA 合成的指定模板可以用來合成長度確定的RNA 轉(zhuǎn)錄物，如果某未知RNA的長度必須要精確知道的時(shí)候可以采用。

溴酚藍(lán)和二甲苯腈藍(lán)可以用來做指示染料。就像在DNA 電泳中一樣，其確切的位置取決于瓊脂糖的品質(zhì)與濃度（見表1) 。

表1 RNA 甲醛膠中跟蹤染料的遷移

?甲醛膠

?二甲苯腈藍(lán)溴酚藍(lán)

SeaKem Gold??

1.0%6300660

1.5%2700310

2.0%1500200

SeaKem GTG 與LE??

1.0%4200320

1.5%1700140

2.0%82060a

SeaPlaque SeaPlaque GTG??

1.0%2400240

1.5%80080a

2.0%49030a

a 外推法確定的與染料遷移相當(dāng)?shù)暮塑账釘?shù)。

＊樣式

RNA 凝膠就像DNA 凝膠一樣進(jìn)行電泳。并不需要獨(dú)立的膠盒與儀器。只要在電泳前后清洗膠盒就可以了。

＊緩沖液

10 x MOPS/EDTA 緩沖液，包含0.2mol/L MOPS (3 – 嗎琳代丙磺酸）、50 mmol/L乙酸鈉、10 mmol/ L EDTA, 調(diào)至pH7.0 。高壓滅菌15min。時(shí)間長了呈現(xiàn)淡黃色是正常的。1 X 用于電泳。

MOPS 緩沖液（和其他RNA 緩沖液）離子強(qiáng)度很低，電泳過程中，沿著膠的長度方向會產(chǎn)生pH 梯度，導(dǎo)致膠的水解。只有在非常長的電泳過程中才可能出現(xiàn)，可以通過用蠕動泵循環(huán)緩沖液或者間歇性地把緩沖液從一端吸到另一端來避免這個(gè)問題。

＊凝膠

RNA 必須在變性條件下電泳。MOPS－甲醛膠是最安全最好的一種。

甲醛膠必須在通風(fēng)櫥內(nèi)倒膠，并靜待固化。熱的甲醛會蒸發(fā)，吸入很危險(xiǎn)。做之前要請別人指導(dǎo)。

含甲醛的瓊脂糖凝膠比普通瓊脂糖凝膠易碎，必須小心操作。

1％或者1.2 ％的膠適用于大多數(shù)Northern 印跡。

＊電源

對電源的要求同DNA 瓊脂糖凝膠。對于中等大小的膠， l00V （大約50 mA) 大約3~4 小時(shí)。

＊染色

由于溴化乙錠已包含在樣品緩沖液中，不需要進(jìn)一步染色。

＊分析

核糖體亞基應(yīng)該是分開的。除非上樣太多，否則各亞基不應(yīng)該分不清楚，如果不能分清意味著降解。

mRNA, 如果在膠上可見，看起來像是一片糊狀。