細(xì)胞注釋是單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析的重要環(huán)節(jié)，來自加拿大的研究人員在《Nature protocols》發(fā)表細(xì)胞注釋教程綜述，介紹了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析中細(xì)胞注釋的一般工作流程，涵蓋可用于每個(gè)步驟的軟件工具和資源的指導(dǎo)原則和具體建議。
Tutorial: guidelines for annotating single-cell transcriptomic maps using automated and manual methods

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此篇教程建議的細(xì)胞注釋分析流程主要有三個(gè)步驟：自動注釋、手動注釋和驗(yàn)證。

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1. 步驟1：自動注釋

自動注釋是使用算法和適當(dāng)?shù)南闰?yàn)生物學(xué)知識標(biāo)記細(xì)胞或細(xì)胞簇的有效方法。一般原則是識別單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞簇中與已知細(xì)胞類型或狀態(tài)的特征基因表達(dá)特征相匹配的基因表達(dá)信號（模式或特征）；然后為細(xì)胞或細(xì)胞簇分配相應(yīng)的標(biāo)簽，標(biāo)簽通常有一個(gè)相關(guān)的置信度得分。
有兩種主要的自動注釋方法：一種是使用已知的標(biāo)記基因，標(biāo)記基因和細(xì)胞類型之間的已知關(guān)系可從數(shù)據(jù)庫中獲得，如SCSig、PanglaoDB和CellMarker，或從文獻(xiàn)中手動獲得。第二種方法是將需要注釋的scRNA-seq數(shù)據(jù)（"查詢 "數(shù)據(jù)集）與現(xiàn)有的、類似的、經(jīng)過專業(yè)注釋的scRNA-seq數(shù)據(jù)集（"參考 "數(shù)據(jù)集）進(jìn)行比較,"參考 "數(shù)據(jù)集來源于GEO、單細(xì)胞表達(dá)圖譜或細(xì)胞圖譜項(xiàng)目等。

1.1 基于標(biāo)記的自動注釋方法

> 為了標(biāo)記單個(gè)細(xì)胞，最可靠的基于標(biāo)記的注釋工具之一是半監(jiān)督類別識別和分配（SCINA）。

> AUCell是另一種很好的基于標(biāo)記的標(biāo)記方法，可以對單個(gè)細(xì)胞或簇進(jìn)行分類。

> 為了標(biāo)記整個(gè)聚類，基因集變異分析（GSVA）已被證明是快速可靠的。

優(yōu)點(diǎn)：基于標(biāo)記的自動注釋方法只將標(biāo)簽分配給與已知標(biāo)記相關(guān)聯(lián)的細(xì)胞，而其他細(xì)胞將保持未標(biāo)記狀態(tài)。

潛在問題：不是所有細(xì)胞類型都容易獲得標(biāo)記基因；可能導(dǎo)致細(xì)胞標(biāo)簽沖突或缺失。

解決策略：需要專業(yè)研究擴(kuò)展標(biāo)記列表

1.2 基于參考數(shù)據(jù)集的自動注釋方法

scmap是基于參考數(shù)據(jù)集的自動細(xì)胞或細(xì)胞簇注釋的最佳工具之一，它既能保證指定標(biāo)簽的準(zhǔn)確性，又能避免對新細(xì)胞類型的錯(cuò)誤標(biāo)記。其他工具包括SingleCellNet和SingleR。

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基準(zhǔn)研究顯示，自動注釋工具的性能各不相同，取決于數(shù)據(jù)集和要注釋的細(xì)胞類型基因表達(dá)譜的獨(dú)特性。當(dāng)對一個(gè)數(shù)據(jù)集應(yīng)用多種細(xì)胞注釋方法時(shí)，細(xì)胞或細(xì)胞簇會獲得多個(gè)，有時(shí)是相互沖突的細(xì)胞類型標(biāo)簽。如果存在沖突，大多數(shù)工具提供的標(biāo)簽置信度分?jǐn)?shù)可以用來識別一個(gè)單一的高分標(biāo)簽。然而，不同工具之間的置信度分?jǐn)?shù)并不統(tǒng)一，所以它們通常不具有可比性。沖突也可以通過多數(shù)規(guī)則的方法來解決，即選擇最頻繁的標(biāo)簽等。如果不能有把握地決定任何標(biāo)簽，則必須對細(xì)胞或群組進(jìn)行人工注釋。

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步驟2：人工注釋

在人工注釋中，使用各種資源對細(xì)胞進(jìn)行人工檢查，以獲得其功能的線索，這與基于標(biāo)記的自動注釋的原則相同。專業(yè)的人工注釋通常被認(rèn)為是細(xì)胞注釋的金標(biāo)準(zhǔn)；然而，其是緩慢和勞動密集型的工作，而且可能是主觀的。

如果沒有進(jìn)行自動注釋，應(yīng)首先手動應(yīng)用基于標(biāo)記的注釋。常使用的查看標(biāo)記基因表達(dá)的圖有tNSE、UMAP 和熱圖等，如果一個(gè)已知細(xì)胞類型的許多標(biāo)記基因在一個(gè)簇中的細(xì)胞中高度表達(dá)，這往往足以支持它被標(biāo)記為該細(xì)胞類型。易于使用的軟件，如免費(fèi)的Loupe Cell Browser for 10x Genomics scRNA seq data，支持這種可視化和分析過程。這種方法面臨的挑戰(zhàn)是，已知標(biāo)記的數(shù)量通常太少，無法完全注釋scRNA序列數(shù)據(jù)集，并且一些已知標(biāo)記在scRNA序列數(shù)據(jù)集中可能不像預(yù)期的那樣特異。額外的標(biāo)記通常必須通過搜索文獻(xiàn)和挖掘現(xiàn)有的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來手動尋找與查詢數(shù)據(jù)集相關(guān)的基因表達(dá)特征。

在某些情況下，一個(gè)簇可能不表達(dá)任何已知的細(xì)胞類型的標(biāo)志物；相反，它可能表達(dá)一種以上的細(xì)胞類型的標(biāo)志物。這就需要doublet檢測工具幫助確定集群是否由doublet組成。

一旦來自已知標(biāo)記物的細(xì)胞類型信息被用盡，必須逐簇手動檢查未被可靠注釋的細(xì)胞。然后手動研究所有標(biāo)記基因，以找到可能有助于識別與其相關(guān)的簇的細(xì)胞類型的功能信息。信號通路富集分析也應(yīng)適用于每個(gè)簇，使用標(biāo)準(zhǔn)的工作流程和工具，如基因組變異分析（GSVA）或單樣本基因組富集分析（ssGSEA）來確定簇的特定信號通路。

一些細(xì)胞可能很難注釋，包括新的細(xì)胞類型，可以根據(jù)它們表達(dá)的基因的功能來描述。此外，可能特別難以區(qū)分相同類型的組織駐留細(xì)胞（例如，組織駐留巨噬細(xì)胞）和非組織駐留細(xì)胞（例如，血液中循環(huán)的單核細(xì)胞）。識別組織駐留細(xì)胞的一種方法是修改實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過灌注步驟從相關(guān)組織中移除passenger cells。

最后，在注釋細(xì)胞類型時(shí)需要謹(jǐn)慎地使用標(biāo)準(zhǔn)術(shù)語，以便細(xì)胞圖譜更容易在不同的研究中被整合。

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步驟3：驗(yàn)證

上述工具和方法可以為scRNA-seq數(shù)據(jù)提供可靠的細(xì)胞類型標(biāo)記。由于mRNA檢測只能部分定義細(xì)胞類型和功能，關(guān)于新型細(xì)胞類型的重要結(jié)論必須經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。例如可以使用T細(xì)胞受體（TCR）和B細(xì)胞受體克隆分型來細(xì)化組織駐留免疫細(xì)胞的細(xì)胞類型標(biāo)簽，以檢查T細(xì)胞和B細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄特征。

分析流程的建議

細(xì)胞類型注釋的質(zhì)量受許多數(shù)據(jù)分析流程參數(shù)的影響，如數(shù)據(jù)過濾和數(shù)據(jù)質(zhì)量設(shè)置，以及選擇的聚類分辨率。scClustViz、Seurat和clustree等工具有助于選擇適當(dāng)?shù)木垲惙直媛?/strong>。為了識別稀有細(xì)胞類型，在對細(xì)胞進(jìn)行聚類之前，可能需要使用特征選擇工具專門識別稀有細(xì)胞類型的標(biāo)記（例如GiniClust85）。對于技術(shù)原因引入的“背景污染”可以使用SoupX（尋找細(xì)胞類型標(biāo)記的非特異性表達(dá)）或CellBender（使用機(jī)器學(xué)習(xí)校正細(xì)胞表達(dá)譜）等方法來評估和校正。