1. 建庫及全流程原理參考illumina測序介紹

NGS006 illumina測序

2. MGISEQ介紹

華大智造基因測序儀采用先進的DNBSEQTM測序核心技術，主要包括:DNA單鏈環(huán)化，DNB制備，規(guī)則陣列芯片（Patterned Array），DNB加載，cPAS（combinatorial Probe Anchor Synthesis聯(lián)合探針錨定聚合測序法）,雙端測序技術，CoolMPS，以及配合的流體和光學檢測技術和堿基識別算法等。

3. 測序原理

• 華大MGI文庫構建過程，采用泡狀接頭及與之相對應的擴增引物。與illumina相似，接頭也同樣具有長接頭及短接頭，單端及雙端index，此部分詳見illumina文庫構建
• 文庫構建流程及原理詳見illumina文庫構建

4. 文庫制備

過程

以單鏈環(huán)狀DNA為模板，在DNA聚合酶作用下進行滾環(huán)擴增（Rolling circle amplification, RCA），將單鏈環(huán)狀DNA擴增到約500拷貝擴增產物稱為DNB?；赗CA的線性擴增技術，每次擴增都是以原始的DNA單鏈環(huán)為模板，使用保真性極高的聚合酶（phi29 DNA polymerase），使得在DNB的所有拷貝的同一個位置上出同樣的錯的幾率幾乎是零。RCA擴增技術有效的避免了PCR擴增錯誤指數(shù)積累的問題，從而大大提高測序的準確性

DNB合成

文庫環(huán)化

將帶有接頭序列的雙鏈DNA（double-stranded DNA，dsDNA），通過高溫變性形成單鏈DNA （single-stranded DNA，ssDNA），環(huán)化引物與ssDNA的兩端互補配對，在連接酶的催化下，ssDNA的首尾相連接，形成單鏈環(huán)狀DNA。

ssDNA環(huán)狀單鏈文庫

RCA擴增生成DNB

通過RCA擴增，可以將1copies原始ssCirDNA文庫分子擴增得到約500copies

滾環(huán)擴增

Patterned array flowcell

采用先進的半導體精密加工工藝，在經過修飾的硅片表面形成結合位點陣列（spot直徑約200nm），實現(xiàn)DNA納米球（約220-240nm）的規(guī)則排列吸附。陣列芯片修飾位點的間距均一（約700nm），每個位點只固定一個DNB，可保證不同納米球的光信號不會互相干擾，這不僅保證了測序準確度，而且提高了測序芯片的利用效率

Patterned array flowcell

DNB loading

DNB在酸性條件下帶負電，在表面活化劑的輔助下，通過正負電荷的相互作用，被加載到芯片中有正電荷修飾的活化位點（直徑約200nm）的過程，稱為DNB加載。DNB直徑略大于芯片上活化位點的直徑，避免了多個DNB結合到同一個位點的情況

DNB加載

5. 測序

cPAS 流程

cPAS流程

正向read1測序

DNB含有約500 DNA fragment copies，也即可以與500條Read1引物退火結合，進行一鏈cPAS測序。

一鏈測序

二鏈測序

• MDA擴增原理（Multiple displacement amplification）

  
  
  多重置換擴增

• 在Read1測序結束后，DNA會繼續(xù)延伸，此時處于上游的Read1引物延伸鏈，在遇到下游緊鄰的Read1引物延伸的雙鏈時，Phi29 DNA polymerase會將其置換下來，并繼續(xù)延伸。當被置換下來的延伸鏈長度超過1copies，則會暴露末端的Read2引物結合位點，通常一鏈結束后，會繼續(xù)向前合成延伸3-5 copies，被置換的大量單鏈DNA即為二鏈的模板，此時Read2引物即可以退火結合在被置換出來的延伸鏈上進行二鏈cPAS測序，而且二鏈的copies更多，熒光信號會比一鏈信號更強。

  
  
  二鏈測序

Barcode測序

index 測序

CoolMPS

• cPAS與CoolMPS
  傳統(tǒng)的cPAS與illumina SBS一樣，使用的dNTP都是3’-block reversible terminator，也是華大與illumina的重點專利糾紛，華大智造在2019年3月美國AGBT大會上發(fā)布了一種新的核苷酸標記技術-CoolMPSTM，該技術也是基于3’-O blocker reversible terminator，但是4種熒光是標記在了可特異性識別3’-O blocker堿基的抗體上，當測序結束，采集完熒光信號以后，3’-O-blocker被切除，熒光標記會隨抗體一起脫落，這樣堿基就變成了天然無修飾的狀態(tài)引入DNA鏈，也就說CoolMPSTM確實是一種無損堿基合成技術

  
  
  cPAS對比

• CoolMPS測序原理
  CoolMPS實質上可以理解為聯(lián)合探針錨定聚合技術（cPAS, Combinatorial Probe-Anchor Synthesis，或稱為StandardMPS）的升級版，它使用的核苷酸是堿基上未標記熒光的dNTPs（cold dNTPs）。coolMPS由于dNTP僅有3’ blocker可逆封端，熒光標記在特異性抗體上，在DNA的合成過程中會隨著3’-blocker被切除，相當于加入的每一個dNTP都是天然狀態(tài)，而傳統(tǒng)的cPAS及illumina SBS使用的dNTP除了3’ blocker之外，還有在堿基上修飾有熒光標記，在切除熒光標記之后，會有l(wèi)inker殘留，并會隨著DNA的測序不斷積累，進而影響DNA聚合酶的活性，也就是所謂的“馬拉松效應”，illumina稱之為Phasing/Prephasing，而MGI稱之為lag/runon。所以與之相比，CoolMPS具有更低的測序錯誤率，更好的測序質量及更高的數(shù)據產量。

  
  
  CoolPAS測序原理

• CoolMPS測序流程

  
  
  CoolPAS測序流程

華大 Protocol

以華大測序反應通用試劑盒為例（環(huán)化部分）

PCR文庫純化后質檢

使用 Qubit? dsDNA HS Assay Kit或 Quant-iT PicoGreen? dsDNA Assay Kit等雙鏈 DNA熒光定量，按照定量的操作說明對 PCR純化后產物進行定量。要求最終 PCR產 物的摩爾量≥1 pmol，請參照如下公式 1進行計算，例如 ：主帶 300 bp的打斷產物 ，PCR產物主片段大小產物主片段大小 384 bp，其產量應達到產量應達到 250 ng。如需將多個樣本混合測序，建議根據 MGIEasy DNA Adapters說明書使用規(guī)則設計混合方案（參照附錄 B），在定量后進行不同 Adapters樣本混合，樣本混合后總量為 1 pmol，總體積 ≤48 μL。
1 pmol PCR產物對應的質量（ng）=（DNA主片段大小/bp）/1000bp×660ng
通過 Bioanalyzer、Tapestation (Agilent Technologies)；LabChip? GX、GXII、GX Touch
(PerkinElmer)；Fragment AnalyzerTM (Advanced Analytical)等基于電泳分離原理的設備對 PCR 純化后產物進行片段分布檢測。

變性

• 根據 PCR 產物主片段分布，取 1 pmol PCR 產物至新的 0.2 mL PCR 管中，用 TE Buffer 補充至總體積 48 μL。
• 將上述 PCR 管置于 PCR 儀上，按照下表的條件進行反應：1）熱蓋，On；2）95℃，3min
  -反應結束后，立即將 PCR 管轉移到冰上，靜置 2 min 后瞬時離心。

單鏈環(huán)化

• 在冰上配制單鏈環(huán)化反應液：

  
  
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• 用移液器吸取 12.1 μL 配制好的單鏈環(huán)化反應液加入4.2.3 中的PCR 管，渦旋震蕩 3 次，每次 3 s，瞬時離心將反應液收集至管底。
• 將 PCR 管置于 PCR 儀上，按照下表的條件進行反應：1）熱蓋，On；2）37℃，30 min；3）4℃，hold
• 反應結束后，瞬時離心，將 PCR 管轉移到冰上，立即進入下步反應

酶切消化

-在步驟 3.10.3 反應時，提前在冰上配制酶切消化反應液

image.png

• 用移液器吸取 4 μL 配制好的酶切消化反應液加入步驟4.3.4的 PCR 管中，渦旋震蕩 3 次，每次3 s，瞬時離心將反應液收集至管底。
• 將 PCR 管置于 PCR 儀上，按照下表的條件進行反應：1）熱蓋，On；2）37℃，30 min；3）4℃，hold

酶切消化產物純化

• 吸取 170 μL DNA Clean Beads 至酶切消化產物中，充分混勻。
• 加入 500 μL 的80%乙醇洗滌兩次
• 加入32μl的TE buffer洗脫，取30 μl。

酶切消化產物質檢

使用 Qubit? ssDNA Assay Kit 熒光定量試劑盒，按照定量試劑盒的操作說明對酶切消化純化后產物進行定量。最終要求酶切消化產物產量（ssDNA）/ PCR 投入量（dsDNA）≥7%。例如：主帶 300 bp 的打斷產物，PCR 產物主片段大小為 384 bp，投入 250 ng 進行環(huán)化，其酶切消化產物產量應不少于 17.5 ng。

文庫定量

-初始文庫 DNA 濃度≥ 2fmol/μL，文庫需用 Qubit? ssDNA HS Assay Kit 和 Qubit? Fluorometer定量，根據定量的結果計算投入量。
-注：投入體積 V（μL）=N×330 g/mol×40 fmol/(1000×1000×C)
-N 表示核苷酸數(shù)目（文庫總片段長度），C 表文庫濃度ng/μL

DNB 制備

• DNB 制備試劑準備
  取出 TE 緩沖液、App-A DNB 制備緩沖液、DNB 聚合酶混合液 I、DNB 聚合酶混合液 II（LC）和 DNB 終止緩沖液，置于冰盒上，待融化后用漩渦振蕩器震蕩混勻 5 秒后，短暫離心置于冰盒上備用。
  注意：不要將 DNB 聚合酶混合液 II（LC）室溫解凍，不要用手長時間觸碰管壁！

• DNB 制備
  1）DNB 制備體系1

  
  
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  2）DNB反應條件1

  
  
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  3）DNB 制備體系2
  
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  4）DNB反應條件2
  
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  當溫度達到 4℃后立即取出 PCR 管，置于冰盒上，即刻加入 20μL DNB 終止緩沖液，用移液器和闊口吸頭緩慢地吹打混勻，切勿震蕩及劇烈吹打，置于4℃保存?zhèn)溆?。注意：混?DNB 時一定要用闊口吸頭緩慢吹打。

• DNB 濃度測定
  取 2μL 步驟2.2.5 產物，用 Qubit? ssDNA Assay Kit 和 Qubit? 熒光計，參照廠家說明書進行濃度測定。以 DNB 濃度≥8 ng/μL 為合格標準，對濃度低于 8 ng/μL 的 DNB需重新制備，對濃度高于40 ng/μL 的 DNB 需用 DNB 加載緩沖液 I 稀釋到20 ng/μL。DNB 放置在4℃保存?zhèn)溆谩?/li>

測序

測序平臺

• 基因測序儀分類

  
  
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• MGISEQ 2000

  
  
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• MGISEQ T7

  
  
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