19年的一篇nature immunology

1. Single-cell analyses show unique cardiac macrophage subsets.

Fig 1a： 對心臟CD45⁺CD64⁺CD11b⁺巨噬細胞的分析提示新生鼠出生14天后心臟只存在一個CCR2^–MHC-II^lo macrophage subset，而成年鼠(>12周)心臟中檢測到了額外的CCR2⁺MHC-II^hi 和 CCR2^–MHC-II^hi巨噬亞群。

CCR2⁺MHC-II^hi 和 CCR2^–MHC-II^hi巨噬是從CCR2^–MHC-II^lo巨噬分化來的？

Fig 1b： To quantify monocyte dependence, we paired Ccr2^?/? mice (Rosa26^+/+), which lack circulating Ly6C^hi monocytes, with Ccr2^+/+ mice, which carried a constitutively expressed gene encoding the membrane-localized TdTomato (Td) reporter in the Rosa26 locus (Rosa26mTmG/mTmG; R26 mTmG), for 6 months. 流式結果顯示Ccr2^?/? 鼠的心臟組織中大多數(shù)CCR2⁺ macrophages (>80%) 和一小群CCR2^–MHC-II^hi macrophages (~25%) 被循環(huán)中Ccr2^+/+ (Td⁺)單核起源的巨噬所取代，而CCR2^–MHC-II^lo巨噬則只有少部分(~12% Td⁺)被替換。

共生鼠是吧，也不畫個示意圖...正常情況下Ccr2^?/? 鼠心臟巨噬全是無熒光的，當Ccr2^?/? 鼠和CCR2⁺(Td⁺)鼠血供相通后，Ccr2^?/? 鼠心臟中來自循環(huán)的外周巨噬細胞和由血供補充的組織CCR2⁺組織原位巨噬都會帶紅光。

Fig 1c-e： 由于心臟中還存在著可以表達巨噬marker的異質(zhì)性的DC (cDC1 and cDC2)，隨后作者分選了成年鼠心臟CD45⁺CD64⁺CD11b⁺巨噬和CD45⁺CD64^?CD11c⁺MHC-II^lo–hi樹突，1:1混合之后進行了單細胞測序。得到1780個細胞，分為11個群。包括4個巨噬群(1, 2, 3, 5)，一個單核群(4)，兩個cDC群(CD209a cDC2, cluster 7; and XCR1 cDC1, cluster 8) 和一個DCs (9) 以及兩個增殖群 (10a, 10b) 和一個APC群(6)。
Fig 1f： 四群巨噬中，1群被定義為Timd4 cluster、2群誒定義為Mhc-II cluster、 3群被定義為Ccr2 cluster、5群被定義為Isg cluster。
Fig 1g： 富集分析提示Timd4 群主要參與穩(wěn)態(tài)和再生功能包括endocytosis, lysosome function, angiogenesis and regeneration等。其他群也有各自的功能。

2. Single-cell trajectories reveal developmental relationships.

為了確定單核細胞和巨噬細胞亞群之間的分化關系，作者對他們了重新降維（圖2a），并計算了偽時間軌跡。分析表明Timd4群中的巨噬細胞占據(jù)了一個單獨的軌跡分支（圖2b）。Ccr2和Isg群以及單核細胞占據(jù)了第二個分支（圖2b），而Mhc-II群中的巨噬細胞跨過了所有三個分支（圖2b）。Mpath算法顯示了類似的排序，并表明Isg巨噬可能來自Ccr2巨噬，而不是單核細胞（圖2c），Monocle得到了類似的結果（圖2d）。
然后使用Monocle可視化了基因表達隨時間軸的變化，以跟蹤不同巨噬細胞狀態(tài)的變化。Klf2、Mafb和Maf在Ccr2群中表達較低，在Mhc-II群中較高，在Timd4群中進一步增加（圖2e,f），表明這些轉(zhuǎn)錄因子與心臟巨噬細胞的命運有關。MHC-II群下調(diào)的基因，Cx3cr1和Il1b與Timd4、Lyve1和Igf1在Timd4群中的表達增加有關（圖2e,f）。相比之下，Ccr2、Mhc-II和Isg群似乎構成了一個相關譜系組，Isg群采取了獨特的激活狀態(tài)，集中在I型IFN信號的周圍。Tracking gene expression changes across macrophage states revealed coordinated patterns defining macro- phage subset identification and functions.

3. Cx3cr1-based mapping tracks resident cardiac macrophage fate.

Fig 3a： 為了追蹤不依賴于血液單核細胞的心臟巨噬，作者使用了tamoxifen誘導的Cx3cr1^{CreERT2–IRES–YFP} (termed Cx3cr1^CreER–YFP) 和 Rosa26-stop- TdTomato reporter mice (termed Cx3cr1^CreER–YFP:R26^Td)。
Fig 3b： 作者對3周小鼠給予了10天tamoxifen-containing chow，隨后給了normal chow for 1–10 weeks。在給tamoxifen之前，CD115⁺CD11b⁺Ly6c⁺外周血單核幾乎沒有Td⁺細胞 (<0.2%)。在給予tamoxifen之后，外周血Ly6c⁺ blood monocytes迅速出現(xiàn)大量Td⁺細胞 (92–95%)。而在停止給tamoxifen2-3周后又回到了baseline (<0.5%)。超過90%的CD11b⁺CD64⁺總心臟巨噬在給予tamoxifen后快速變成Td⁺。而在5w之內(nèi)，CCR2^-心臟巨噬持續(xù)Td⁺，而CCR2⁺心臟巨噬在停止tamoxifen后逐漸丟失了Td表達，consistent with replacement of CCR2⁺ macrophages by unlabeled monocytes.

Studies have shown robust tamoxifen-inducible reporter gene expression in Cx3cr1-expressing resident macrophages and transient labeling of blood monocytes

Fig 3c： 隨后作者在tamoxifen停止20w后的小鼠心臟中，根據(jù)單細胞篩選出來的組織原位巨噬細胞marker進行了檢測。CCR2^–MHC-II^loTIMD4⁺心臟巨噬仍保持著很高的Td⁺(~90%)，CCR2^–MHC-II^hiTIMD4^?巨噬約 ~75% Td⁺，CCR2⁺MHC-II^hiTIMD4^– 巨噬則約 15–20% Td⁺。
Fig 3d： 共生鼠的結果則顯示CCR2^–MHC-II^loTIMD4⁺巨噬 had very little donor chimerism (~2%)，CCR2^–MHC-II^hiTIMD4^?巨噬with ~20% chimerism by parabiosis，CCR2⁺MHC-II^hiTIMD4^– 巨噬 with almost complete chimerism (~90%) in parabiotic studies.
Thus, CCR2 expression alone identified a subset of cardiac macrophages that were fully replaced by blood monocytes in adult mice, and by stratifying the remaining macrophages by TIMD4 and MHC-II, we identified macrophage subsets with limited monocyte dependence.

4. Resident macrophages are lost within infarcted myocardium.

Fig 4a： 為了探究組織原位巨噬在無菌性炎癥中的動態(tài)變化，作者使用了心梗模型。作者對3w大Cx3cr1^CreER–YFP:R26^Td小鼠給予了10天tamoxifen，六周后小鼠被用于心梗造模。之后作者對ischemic zones (infarct and peri-infarct tissue) 和 remote (noninfarcted) zones進行了流式檢測。
Fig 4b： 結果顯示和對照相比，造模2天后梗死區(qū)resident Td⁺ macrophages絕對數(shù)包括CCR2^?MHC-II^loTIMD4⁺ 和 CCR2^?MHC-II^hiTIMD4^–)減少了～60%，而在隨后的時間里(days 4–28)其絕對數(shù)逐漸增加。而recruited Td^? macrophages數(shù)量下降。
Fig 4c-d： 然而梗死后4周，resident macrophages 和 recruited macrophages 的比例并沒有恢復到梗死前的水平。
Fig 4e： 在steady state下，原位CCR2^?MHC-II^hiTIMD4^–巨噬～75%是Td⁺，而梗死后只有～5%仍然是Td⁺，提示招募的巨噬占了絕大部分。與此相反，baseline時，CCR2^?MHC-II^loTIMD4⁺巨噬～90%是Td⁺，梗死后2d和28d下降到～75%，indicating that TIMD4 expression was maintained on resident Td⁺ macrophages and recruited macrophages did not become TIMD4⁺, even at 28 d after infarction.
Fig 4f： 免疫熒光結果也提示梗死兩天后梗死區(qū)的Td⁺ cardiac macrophages丟失了70%, with a progressive increase in density over 28 d.
Fig 4g, h： 隨后作者使用BrdU檢測了巨噬細胞增殖情況，結果顯示巨噬細胞在心臟梗死后2-4天增殖最強。

5. Recruited cardiac macrophage plasticity in infarcted tissue.

隨后作者對梗死后11天心臟梗死區(qū)巨噬進行了單細胞測序，得到了11種細胞，有7群是在梗死心臟特有的，而且它們主要來源于 Td^–單核細胞。7群中有4群是巨噬(8-11)，1群DC(7)。特有的四群巨噬促炎功能顯著更強。軌跡分析揭示了單核向巨噬的分化過程，隨著這個過程，一些缺氧相關基因也出現(xiàn)上調(diào)。

6. Cardiac macrophage heterogeneity in human cardiomyopathy.

作者對心?；颊叩男呐K巨噬也進行了分析，得到了三群：CCR2^?MHC-II^hi, CCR2⁺MHC-II^hi 和 CCR2⁺MHC-II^lo。同樣的，人CCR2^?MHC-II^hi群表達在小鼠組組織原位細胞中檢測到的marker如TIMD4, LYVE1, CD163, FOLR2, IGF1 和 MAF (f附件)。
Thus, CCR2 defines recruited monocytes and monocyte-derived macrophages in both mouse models and human cardiomyopathy.

7. Cx3cr1-based depletion post-infarct worsens cardiac function.

最后，作者使用Cx3cr1^CreER–YFP:R26^Td/DTR鼠來標記組織原位巨噬并使用白喉毒素來選擇性的清除resident Td⁺ cardiac macrophages。結果顯示清除了組織原位巨噬的小鼠梗死更重，死亡率更高。