富集分析
基因富集分析（gene set enrichment analysis）是在一組基因或蛋白中找到一類過(guò)表達(dá)的基因或蛋白。研究方法可分為三種：Over-Repressentation Analysis(ORA)，F(xiàn)unctional Class Scoring(FCS)和Pathway Topology。ORA是目前應(yīng)用最多的方法，GO富集分析和KEGG富集分析就是使用的這種方法；FCS這種方法應(yīng)用于GSEA分析。
功能分析（functional analysis）/ 通路分析（pathway analysis）是將一堆基因按照基因的功能/通路來(lái)進(jìn)行分類。換句話說(shuō)，就是把一個(gè)基因列表中，具有相似功能的基因放到一起，并和生物學(xué)表型關(guān)聯(lián)起來(lái)。GO分析是將基因分門別類放入一個(gè)個(gè)功能類群，而pathway則是將基因一個(gè)個(gè)具體放到代謝網(wǎng)絡(luò)中的指定位置。
為了解決將基因按照功能進(jìn)行分類的問(wèn)題，科學(xué)家們開發(fā)了很多基因功能注釋數(shù)據(jù)庫(kù)。這其中比較有名的就是Gene Ontology（基因本體論，GO）和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（京都基因與基因組百科全書，KEGG）。
GO
GO數(shù)據(jù)庫(kù)是基因本體論聯(lián)合會(huì)（Gene Ontology Consortium）建立的一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)（官網(wǎng)http://geneontology.org/），旨在建立一個(gè)適用于各種物種的、對(duì)基因和蛋白功能進(jìn)行限定和描述的，并能隨著研究不斷深入而更新的語(yǔ)義詞匯標(biāo)準(zhǔn)。分別從分子功能、參與的生物途徑及細(xì)胞中的定位對(duì)基因產(chǎn)物進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化描述，一個(gè)基因?qū)?yīng)有一個(gè)或多個(gè)GO term（GO功能），一個(gè)term對(duì)應(yīng)多個(gè)gene。
GO注釋分為三大類，分別是：分子生物學(xué)功能（Molecular Function，MF）、生物學(xué)過(guò)程（Biological Process，BP）和細(xì)胞學(xué)組分（Cellular Components，CC），通過(guò)這三個(gè)功能大類，對(duì)一個(gè)基因的功能進(jìn)行多方面的限定和描述。
Cellular component解釋的是基因產(chǎn)物在哪里，在細(xì)胞質(zhì)還是在細(xì)胞核，如果存在細(xì)胞質(zhì)那在哪個(gè)細(xì)胞器上，如果是在線粒體中那是存在線粒體膜上還是在線粒體的基質(zhì)中。
Biological process該基因參與了哪些生物學(xué)過(guò)程，比如參與了rRNA的加工或參與了DNA的復(fù)制。
Molecular function該基因在分子層面的功能是什么，它是催化什么反應(yīng)的。
通常在得到差異表達(dá)基因后，可通過(guò)功能富集分析進(jìn)一步篩選對(duì)生物體具有重要意義的基因。
將篩選得到的基因分門別類放入細(xì)胞組分CC、分子功能MF和生物過(guò)程BP三個(gè)功能類別中，基因產(chǎn)物被盡可能的富集到最低層的功能term上。尋找各個(gè)基因是否有共同的GO條目，或者有沒(méi)有共同的上級(jí)GO條目，可以發(fā)現(xiàn)具有某些共同特點(diǎn)的基因。根據(jù)超幾何分布關(guān)系，GO分析會(huì)對(duì)涉及的GO返回一個(gè)p-value，小的p值表示差異基因在該GO 中出現(xiàn)了富集。GO 分析對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有提示的作用，通過(guò)差異基因的GO 分析，可以找到富集差異基因的GO分類條目，尋找不同樣品的差異基因可能和哪些基因功能的改變有關(guān)。
GO是Gene Ontology的縮寫。本體論是哲學(xué)概念，它是研究存在的本質(zhì)的哲學(xué)問(wèn)題。后來(lái)這個(gè)詞被應(yīng)用到計(jì)算機(jī)界，定義為概念化的詳細(xì)說(shuō)明。在實(shí)現(xiàn)上，一個(gè)ontology往往就是一個(gè)正式的詞匯表，其核心作用就在于定義某一領(lǐng)域或領(lǐng)域內(nèi)的專業(yè)詞匯以及他們之間的關(guān)系，是領(lǐng)域內(nèi)部不同主體之間進(jìn)行交流的一種語(yǔ)義基礎(chǔ)。
使用GO的時(shí)候一般需要GO定義文件和GO關(guān)聯(lián)文件。GO定義文件存放GO詞條的定義，而GO關(guān)聯(lián)文件則是不同命名體系與GO詞條的映射關(guān)系。條目標(biāo)準(zhǔn)定義：
id：GO編號(hào)，如：GO:0031985
name：全稱，Golgi cisterna
ontology：命名空間namespace，cellular_component
definition：定義，Any of the thin, flattened membrane-bounded compartments that form the central portion of the Golgi complex. Source: GOC:mah
條目之間的關(guān)系，采用有向無(wú)環(huán)圖（Directed Acyclic Graphs，DAG）的形式。注釋系統(tǒng)中每一個(gè)節(jié)點(diǎn)就代表了一個(gè)基本描述單元（term），有向指的是term之間的單向指向性關(guān)系，比如termA是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，termB是細(xì)胞器，規(guī)定A是B，卻不能說(shuō)B是A；無(wú)環(huán)指的是從任何一點(diǎn)開始沿著規(guī)定的指向都不能回到原點(diǎn)。
KEGG
KEGG是一個(gè)整合了基因組、化學(xué)和系統(tǒng)功能信息的綜合數(shù)據(jù)庫(kù)。KEGG下屬4個(gè)大類和17個(gè)子數(shù)據(jù)庫(kù)，而其中有一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)叫做KEGG Pathway，專門存儲(chǔ)不同物種中基因通路的信息，也是用的最多的一個(gè)，所以，久而久之，KEGG就被大家當(dāng)做是一個(gè)通路數(shù)據(jù)庫(kù)了。
GO分析好比是將基因分門別類放入一個(gè)個(gè)功能類群，而pathway則是將基因一個(gè)個(gè)具體放到代謝網(wǎng)絡(luò)中的指定位置。根據(jù)挑選出的差異基因，計(jì)算這些差異基因同Pathway 的超幾何分布關(guān)系，Pathway 分析會(huì)對(duì)每個(gè)有差異基因存在的pathway 返回一個(gè)p-value，小的p 值表示差異基因在該pathway 中出現(xiàn)了富集。pathway 分析對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有提示的作用，通過(guò)差異基因的Pathway 分析，可以找到富集差異基因的Pathway 條目，尋找不同樣品的差異基因可能和哪些細(xì)胞通路的改變有關(guān)。pathway 是蛋白質(zhì)之間的相互作用，pathway 的變化可以由參與這條pathway 途徑的蛋白的表達(dá)量或者蛋白的活性改變而引起，因此pathway 分析的結(jié)果更顯得間接。
Over-Repressentation Analysis（ORA）
過(guò)表征分析，其實(shí)就是想看看某類功能或分類和隨機(jī)事件相比是否有更明顯的趨勢(shì)。統(tǒng)計(jì)方法包括Fisher精確檢驗(yàn)、卡方檢驗(yàn)等。Fisher精確檢驗(yàn)是基于超幾何分布計(jì)算的，它分為兩種，分別是單邊檢驗(yàn)（等同于超幾何檢驗(yàn)）和雙邊檢驗(yàn)。超幾何分布檢驗(yàn)常用來(lái)對(duì)venn圖兩個(gè)圈overlap的顯著性進(jìn)行檢驗(yàn)，F(xiàn)isher精確檢驗(yàn)常用來(lái)對(duì)2×2的列聯(lián)表進(jìn)行檢驗(yàn)。
分析列聯(lián)表中兩個(gè)變量的關(guān)聯(lián)，可以采取卡方檢驗(yàn)（Chi-square test）。先假設(shè)兩個(gè)變量之間沒(méi)有關(guān)系（是否在這個(gè)GO term和是否在目標(biāo)基因集沒(méi)有關(guān)系，即目標(biāo)基因集在特定GO term沒(méi)有富集），計(jì)算統(tǒng)計(jì)量：Σ(實(shí)際值-理論值)^2/理論值，然后根據(jù)自由度（等于1）查表得到p值。如果p值小于0.05，說(shuō)明原假設(shè)不成立，即目標(biāo)基因集在特定GO term出現(xiàn)了富集。
卡方檢驗(yàn)最大的優(yōu)勢(shì)在于計(jì)算比較簡(jiǎn)便，可以徒手計(jì)算，Fisher精確檢驗(yàn)的計(jì)算要相對(duì)復(fù)雜些，但是現(xiàn)在實(shí)現(xiàn)起來(lái)也很容易了。對(duì)于2×2列聯(lián)表來(lái)說(shuō)，卡方檢驗(yàn)通常只能做為近似估計(jì)值，特別是當(dāng)總樣本量或理論頻數(shù)比較小的時(shí)候，計(jì)算并不準(zhǔn)確。一般情況下，如果總樣本量大于40，最小理論頻數(shù)大于5，可以使用卡方檢驗(yàn)。但是，如果采用卡方檢驗(yàn)得到的P值在0.05附近時(shí)，應(yīng)該用Fisher確切概率法。如果差異很大，采用卡方檢驗(yàn)和Fisher確切概率法得到的結(jié)果相差不大。現(xiàn)在GO富集分析一般都是使用超幾何分布進(jìn)行計(jì)算的。
富集分析的超幾何分布檢驗(yàn)的p值計(jì)算如下。N為所有基因中具有pathway/GO term注釋的基因數(shù)目；n為N中差異表達(dá)基因的數(shù)目；M為所有基因中注釋為某特定pathway/GO term的基因數(shù)目；m為注釋為某特定pathway/GO term的差異表達(dá)基因數(shù)目。通過(guò)計(jì)算得到的P value會(huì)進(jìn)一步經(jīng)過(guò)多重檢驗(yàn)校正，通常應(yīng)用的是BH方法，得到FDR值。然后以FDR≤0.05為閾值，滿足此條件的pathway/GO term定義為在差異表達(dá)基因中顯著富集的pathway/GO term。此外還有很多其他的算法來(lái)試圖解決一個(gè)基因?qū)?yīng)多個(gè)GO term、一個(gè)term對(duì)應(yīng)多個(gè)gene的問(wèn)題，但是本質(zhì)上也是基于Fisher's exact test。
常見的富集結(jié)果描述包括：
RichFactor，富集因子，是指感興趣基因列表中屬于這個(gè)term的基因的數(shù)量/背景基因集中富集在這個(gè)term中所有基因的數(shù)量。
p值或q值：代表富集顯著程度，可以映射到圖形顏色。
GeneNumber：感興趣基因列表中屬于這個(gè)term的基因數(shù)量。
Gene Percent(%)：感興趣基因列表屬于這個(gè)term的基因的數(shù)量占感興趣基因列表所有基因數(shù)量的百分比
富集分析工具
clusterProfiler
clusterProfiler，它支持ORA和FCS兩類算法。函數(shù)為：enrichGO, gseGO: GO富集分析；enrichKEGG, gseKEGG: KEGG富集分析；enrichDAVID: DAVID富集分析。
DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）是由美國(guó)Leidos 生物醫(yī)學(xué)研究公司的LHRI團(tuán)隊(duì)開發(fā)的一個(gè)在線基因注釋及功能富集網(wǎng)站，最為常用且權(quán)威，引用超高（>21000）。但是它的數(shù)據(jù)庫(kù)版本比較老，目前最新版的DAVID 6.8還是在2016年更新的，而且基本只更新了GO和ID轉(zhuǎn)換的數(shù)據(jù)，KEGG也沒(méi)有更新。聽說(shuō)2016年Nature Methods 專門寫了Impact of outdated gene annotations on pathway enrichment analysis 吐槽大家還在用老舊的DAVID。
GSEA
Gene Set Enrichment Analysis（基因集富集分析）用來(lái)評(píng)估一個(gè)預(yù)先定義的基因集S（已知功能的基因集）的基因在與表型相關(guān)度排序的基因列表L（按照l(shuí)ogFC、Signal to Noise Ratio等排序的基因列表）中的分布趨勢(shì)（是隨機(jī)分布，還是主要分布在頂部或底部），從而判斷其對(duì)表型的貢獻(xiàn)。GSEA確定一個(gè)預(yù)先定義的基因集是否能在兩個(gè)生物學(xué)狀態(tài)中顯示出顯著的一致性的差異，通俗一點(diǎn)就是某個(gè)通路/GO條目中的基因集在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中呈現(xiàn)出一 致的上調(diào)或者下調(diào)趨勢(shì)。
富集分?jǐn)?shù)enrichment score（ES）代表集合S在排序列表L的頂部或底部被過(guò)表達(dá)的程度。這個(gè)分?jǐn)?shù)是通過(guò)遍歷列表L來(lái)計(jì)算的，當(dāng)我們遇到一個(gè)在S中的基因時(shí)增加一個(gè)running-sum statistic（類Kolmogorov-Smirnovlike統(tǒng)計(jì)量），當(dāng)遇到的基因不在S中時(shí)減少統(tǒng)計(jì)量。增量的大小取決于基因統(tǒng)計(jì)（例如基因與表型的相關(guān)性）。ES為random walk中遇到的與零的最大偏差（maximum deviation from zero）。GSEA的那條曲曲折折的線就是通過(guò)不斷的加分減分做出來(lái)的，圖中的每一條垂直線表示基因集S中一個(gè)基因。
利用置換檢驗(yàn)（permutation test）計(jì)算ES的p值。具體地說(shuō)，我們對(duì)基因列表L的gene labels進(jìn)行重新排列（permute），并為排列后的數(shù)據(jù)重新計(jì)算基因集的ES（重復(fù)1000次），從而為ES生成一個(gè)null distribution。然后相對(duì)于這個(gè)零分布計(jì)算觀察到的ES的p值。并使用FDR調(diào)整計(jì)算q值。
各種方法的特點(diǎn)
ORA方法存在一些問(wèn)題：僅使用了基因數(shù)目信息，而沒(méi)有利用基因表達(dá)水平或表達(dá)差異值，為了獲得感興趣或者差異表達(dá)基因，需要人為的設(shè)置閾值。ORA法通常僅使用最顯著的基因，而忽略差異不顯著的基因。在獲得感興趣的基因時(shí), 往往需要選取合適的閾值, 有可能會(huì)丟失顯著性較低但比較關(guān)鍵的基因, 導(dǎo)致檢測(cè)靈敏性的降低；假設(shè)每個(gè)基因都是獨(dú)立的，忽視了基因在通路內(nèi)部生物學(xué)意義的不同（如調(diào)控和被調(diào)控基因的不同）及基因間復(fù)雜的相互作用；ORA假設(shè)通路與通路間是獨(dú)立的，但這個(gè)前提假設(shè)是錯(cuò)誤的。
FCS方法相較于ORA 法在理論上有明顯突破，考慮到了基因表達(dá)值的屬性信息, 以待測(cè)基因功能集為對(duì)象來(lái)進(jìn)行檢驗(yàn), 也使得檢驗(yàn)結(jié)果更加靈敏。認(rèn)為雖然個(gè)體基因表達(dá)改變之后會(huì)更多在通路中體現(xiàn)，但是一些功能相關(guān)基因中較弱但協(xié)調(diào)的變化（small but consistent changes）也有明顯的影響。仍獨(dú)立分析每一條通路，同一個(gè)基因可能涉及多條通路，所以不同通路間的基因出現(xiàn)重疊，別的通路可能由于重疊的基因，也出現(xiàn)顯著富集；仍然把待測(cè)基因功能集中的每個(gè)基因作為獨(dú)立的個(gè)體, 忽略了基因的生物學(xué)屬性和基因間的復(fù)雜相互作用關(guān)系。
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