入門必讀：http://www.itdecent.cn/p/85e2e38df673
Q1:有的群2個(gè)或者3個(gè)不同細(xì)胞類型marker高表達(dá)，這時(shí)候如何給群定義具體哪種細(xì)胞呢？
隨著單細(xì)胞技術(shù)的成熟，僅靠幾個(gè)基因就判定一種細(xì)胞類型的模式可能要重新思考。在單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析中有一個(gè)關(guān)鍵的步驟FindClusters（分群，以啟發(fā)樣本中可能有的細(xì)胞類型數(shù)量），但是這個(gè)目前用的方法是非監(jiān)督聚類，也就是數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)的，不依賴生物學(xué)背景。而某一細(xì)胞類型的marker肯定是要依據(jù)生物學(xué)背景，您說的這種情況，就屬于兩者的矛盾的發(fā)生現(xiàn)場(chǎng)。有兩個(gè)思路供您參考
- 一個(gè)群內(nèi)部有不同細(xì)胞類型的marker表達(dá)，是不是這個(gè)群本身有異質(zhì)性（即有亞群）。
- 找的marker是不是特異的，某些細(xì)胞類型是幾個(gè)marker（有陽性有陰性）的。還有一種情況是分的不同的群有著相同的marker，這時(shí)可以把它們當(dāng)做一個(gè)群。以上，基于FindClusters這個(gè)結(jié)果是符合生物學(xué)意義這一前提。
Q2:如果一個(gè)沒有相似疾病報(bào)道的疾病做單細(xì)胞，細(xì)胞marker怎么確定？
可延伸為如何鑒定一個(gè)新的細(xì)胞類型（即，之前并沒有人明確命名的細(xì)胞類型）。這個(gè)單純靠單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組可能有些困難，可能要輔之以濕實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證（手動(dòng)找marker）。單細(xì)胞已有的分析可以為確定marker的方法有哪些呢？第一個(gè)就是差異分析，檢查marker的特異性；第二個(gè)是軌跡推斷，檢查該細(xì)胞類型與已知細(xì)胞類型之間的分化關(guān)系。鑒于單細(xì)胞技術(shù)之前細(xì)胞類型基本靠流式分選鑒定，建議做單細(xì)胞膜蛋白（傳統(tǒng)是按細(xì)胞功能鑒定的）會(huì)比單純的轉(zhuǎn)錄組好一些。隨著單細(xì)胞技術(shù)的成熟，僅靠幾個(gè)基因就判定一種細(xì)胞類型的模式可能要重新思考
Q3:怎么實(shí)現(xiàn)Seurat對(duì)象 與monocle bioconductor, scanpy，loom之間的轉(zhuǎn)換
參考：單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析||Seurat3.1教程:Interoperability between single-cell object formats
關(guān)于Seurat2和Seurat3的轉(zhuǎn)換：參考scRNA代碼倉庫，有官方說明書
http://www.itdecent.cn/p/396345566479?from=singlemessage&tdsourcetag=s_pcqq_aiomsg
Q4:怎么做細(xì)胞與細(xì)胞互作
celltalker：單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組配受體分析: http://www.itdecent.cn/p/2c2f94b4f072?tdsourcetag=s_pcqq_aiomsg
Q5:關(guān)于單細(xì)胞基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)GRN
活性TFs及其靶基因的組合通常表示為GRNs。探索GRNs是基因組研究領(lǐng)域的主要挑戰(zhàn)之一。一旦確定了驅(qū)動(dòng)并維持細(xì)胞狀態(tài)行為的關(guān)鍵regulators，它們最終就可以用來做干擾這些調(diào)控過程的切入點(diǎn)。比如，結(jié)合一組特異的TFs組合，將成纖維細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（iPS）；許多其他的重編程途徑也是通過特定的TFs組合驅(qū)動(dòng)一個(gè)GRN來促使細(xì)胞狀態(tài)的改變；最近在癌癥治療中進(jìn)行了嘗試，使癌細(xì)胞轉(zhuǎn)成一種易于受特定藥物侵害的狀態(tài)。
- 使用聚類算法將細(xì)胞分為不同的細(xì)胞類型或狀態(tài)
- 通過軌跡推斷方法沿偽時(shí)間軸對(duì)細(xì)胞進(jìn)行排序
從轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)推斷GRNs通常依賴于可以從表達(dá)模式中提取調(diào)控信息的假設(shè)。例如，具有相似行為的那些基因受共同機(jī)制（例如特異性的TF）的調(diào)節(jié)。依據(jù)這樣的假設(shè)，調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（GRN）推斷的目的可以是：
- 對(duì)導(dǎo)致細(xì)胞從一種狀態(tài)轉(zhuǎn)變成另一種狀態(tài)的TF激活事件順序進(jìn)行建模
- 確定TFs潛在的靶標(biāo)基因
- 鑒定一個(gè)細(xì)胞狀態(tài)能夠維持所依賴的特定主要regulators（或regulators組合）。
一類GRN推斷方法著重于解密在動(dòng)態(tài)過程中，細(xì)胞從一種狀態(tài)轉(zhuǎn)換到另一種狀態(tài)所需的TF邏輯組合
這通常是通過布爾網(wǎng)絡(luò)模型實(shí)現(xiàn)的。例如Single-Cell Network Synthesis (SCNS) toolkit和BoolTraineR，通過將每個(gè)細(xì)胞進(jìn)行狀態(tài)分類（基于TF表達(dá)）并連接有限數(shù)量差異的細(xì)胞來構(gòu)建布爾網(wǎng)絡(luò)。生成的狀態(tài)圖能夠讓我們找到參與細(xì)胞狀態(tài)改變的關(guān)鍵TFs，并可用于預(yù)測(cè)TF的過表達(dá)或敲除后的效果。但是，這不涉及有關(guān)靶基因的信息。
另外，網(wǎng)絡(luò)規(guī)模的增加會(huì)導(dǎo)致計(jì)算量的迅速增加。因此，這些工具只能模擬少數(shù)基因（<100）。所以通常選擇相關(guān)TFs子集，再結(jié)合這些方法應(yīng)用于動(dòng)態(tài)過程的軌跡推斷步驟。
調(diào)控網(wǎng)絡(luò)推斷的另一種方法是：將TF與候選靶基因連接，最終目的是確定驅(qū)動(dòng)特定細(xì)胞狀態(tài)的“主要regulators”
此類別中的一種主要方法是基于共表達(dá)分析并已廣泛用于bulk基因表達(dá)數(shù)據(jù)，例如GENIE3和WGCNA。最近的研究已經(jīng)成功地將相似的方法應(yīng)用于單細(xì)胞數(shù)據(jù)。使用這些方法時(shí)需要考慮的要素包括以下假設(shè)：
regulator表達(dá)水平的變化直接影響下游靶標(biāo)的表達(dá)
忽略了轉(zhuǎn)錄后調(diào)控
忽略了并非所有co-varying基因都一定是直接作用的靶標(biāo)
這些方法對(duì)normalization和batch-effects敏感，可能會(huì)引入人工協(xié)變量
基于共表達(dá)算法的其中一部分算法專門針對(duì)動(dòng)態(tài)過程中的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)構(gòu)建GRN模型。這些方法結(jié)合細(xì)胞沿時(shí)間軸的初始順序（或預(yù)測(cè)的軌跡），同時(shí)對(duì)基因和調(diào)節(jié)子之間的表達(dá)動(dòng)態(tài)進(jìn)行建模，使用的技術(shù)包括：(non-linear) correlation、regression、covariance analysis 、multivariant information 、ordinary differential equation (ODE)模型以及其他的模型。
SCENIC workflow 包含3個(gè)主要步驟：
1.用GENIE3（隨機(jī)森林) 或GRNBoost (Gradient Boosting梯度下降) 推斷轉(zhuǎn)錄因子與候選靶基因之間的共表達(dá)模塊。每個(gè)模塊包含一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子及其靶基因，純粹基于共表達(dá)。2.使用RcisTarget分析每個(gè)共表達(dá)模塊中的基因，以鑒定enriched motifs；僅保留TF motif富集的模塊和targets，每個(gè)TF及其潛在的直接targets gene被稱作一個(gè)調(diào)節(jié)子（regulon）3.使用AUCell評(píng)估每個(gè)細(xì)胞中每個(gè)regulon的活性，AUCell分?jǐn)?shù)用于生成Regulon活性矩陣，通過為每個(gè)regulon設(shè)置AUC閾值，可以將該矩陣進(jìn)行二值化（0|1，on|off），這將確定Regulon在哪些細(xì)胞中處于“打開”狀態(tài)。
使用RcisTarget是SCENIC不同于大多共表達(dá)算法的重要區(qū)別。由于GENIE3模塊僅基于共表達(dá)，因此結(jié)果可能包含許多誤報(bào)和間接target，為了鑒定推斷的直接結(jié)合的靶標(biāo)基因，使用RcisTarget對(duì)每個(gè)共表達(dá)模塊進(jìn)行順式調(diào)控基序（motif）分析。僅保留具有正確基因上游調(diào)節(jié)子且顯著富集TF motif的模塊，并對(duì)它們進(jìn)行修剪以除去缺乏基序支持的間接靶標(biāo)，這些處理后的模塊才稱為regulon。
本文Ref參考很重要，作為進(jìn)一步數(shù)據(jù)挖掘分析的基礎(chǔ)
References
[1]癌癥治療: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959437X17300096
[2] 使用聚類算法將細(xì)胞分為不同的細(xì)胞類型或狀態(tài): https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0098299717300493
[3] 通過軌跡推斷方法沿偽時(shí)間軸對(duì)細(xì)胞進(jìn)行排序: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/eji.201646347
[4] 1: https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0010482514000420
[5] 2: https://www.embopress.org/doi/full/10.1038/msb4100120
[6] 3: https://www.nature.com/nmeth/journal/v9/n8/abs/nmeth.2016.html
[7] SCNS: https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-319-21690-4_38
[8] BoolTraineR: https://bmcbioinformatics.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12859-016-1235-y
[9] 對(duì)iPS的重編程建模: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867412010215
[10] Moignard等人的工作: https://www.nature.com/articles/nbt.3154
[11] GENIE3: https://orbi.uliege.be/handle/2268/107580
[12] WGCNA: https://link.springer.com/article/10.1186/1471-2105-9-559
[13] SINCERA: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4658017/
[14] ACTION: https://www.nature.com/articles/s41467-018-03933-2
[15]SCENIC: https://www.nature.com/articles/nmeth.4463
Q6：怎么檢測(cè)fusion? 我們的fusion轉(zhuǎn)錄本在bulk RNA-seq已經(jīng)detect到，表達(dá)豐度也是不錯(cuò)的，那是不是我測(cè)序的深度足夠就有可能捕獲到fusion轉(zhuǎn)錄本呢？
測(cè)序深度是一個(gè)，10X的建庫策略也是需要考慮的，不同轉(zhuǎn)錄本的fusion位置和長度不同，不好說這種可能性有多大
單細(xì)胞結(jié)構(gòu)， SNV/CNV/snp以及fusion都是值得思考的。
10*畢竟不是全長測(cè)序，適不適合以及準(zhǔn)確性需要考慮
STAR-solo:http://www.bio-info-trainee.com/5498.html?tdsourcetag=s_pcqq_aiomsg
Can we detect splice variants or isoforms using single cell 3’ RNA-seq data?：https://kb.10xgenomics.com/hc/en-us/articles/360021902671-Can-we-detect-splice-variants-or-isoforms-using-single-cell-3-RNA-seq-data-?tdsourcetag=s_pcqq_aiomsg
關(guān)于空間轉(zhuǎn)錄組
含源代碼：https://github.com/SpatialTranscriptomicsResearch/st_pipeline大多是python寫的
其他參考文章：http://www.itdecent.cn/p/20df850ed6ca
Seurat新版教程：http://www.itdecent.cn/p/f6da86489784?utm_campaign=haruki
公開課
如果按細(xì)胞大小10um來看，往上的是分辨率更高的亞顯微層面（分辨率和基因檢出數(shù)）有權(quán)衡
目前唯一的商業(yè)化空轉(zhuǎn)產(chǎn)品是10x Visium，優(yōu)勢(shì)在于：可以獲得無偏量的高通量基因表達(dá)，空間分辨率較高(55um，每個(gè)spot的大小（6.5x6.5mm，5000個(gè)spot，每個(gè)不同顏色的spot的barcode不同，一個(gè)spot可以有上百萬條oligoUMI探針)，檢測(cè)面積大(42.5um，像ISH相關(guān)只能檢測(cè)1-幾個(gè)mm^2)，檢測(cè)效率(靈敏度)高，完整、簡易的操作流程，可和現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)方法整合
組織優(yōu)化過程很重要，組織通透化時(shí)間決定了測(cè)序檢測(cè)基因的靈敏度，組織優(yōu)化過程中cDNA添加熒光標(biāo)簽，顯微拍照觀察，通透時(shí)間決定了mRNA的彌散程度，可以設(shè)置時(shí)間梯度選擇優(yōu)化條件
測(cè)序深度與樣本有關(guān)，胚胎、大腦等復(fù)雜樣本建議測(cè)深，肺臟等其他可以淺一些，每個(gè)spot 50k個(gè)reads pair
https://satijalab.org/seurat/v3.1/spatial_vignette.html官網(wǎng)上除了空間轉(zhuǎn)錄組還包含了其他各種vigenettes比如多組學(xué)數(shù)據(jù)整合的guide
組織樣本的厚度一般10um-20um
Practical
參考：https://satijalab.org/seurat/v3.1/spatial_vignette.html
這個(gè)地方我在下載的時(shí)候報(bào)錯(cuò)了：除非運(yùn)氣很好不然大概率會(huì)報(bào)錯(cuò)的，最好是直接找上Github:https://github.com/satijalab/seurat-data 這個(gè)專門的SeuratData包可以當(dāng)做是一個(gè)meta package，管理Seurat支持的數(shù)據(jù)集
devtools::install_github("satijalab/seurat", ref = "spatial")
查看可下載的數(shù)據(jù)集然后下載，如果還不行就手動(dòng)把url對(duì)應(yīng)的包下載到lib，下載好解壓再重新載入數(shù)據(jù)就成功了（可以看到載入以后顯示出已下載的數(shù)據(jù)）：
> library(SeuratData)
-- Installed datasets ------------------------------------- SeuratData v0.2.1 --
√ stxBrain 0.1.1
-------------------------------------- Key -------------------------------------
√ Dataset loaded successfully
> Dataset built with a newer version of Seurat than installed
(?) Unknown version of Seurat installed
注意Visium是以spot為基本單位的，meta.data的每一行為barcode，記錄了每一個(gè)barcode對(duì)應(yīng)的UMI count和測(cè)得的基因數(shù)（一個(gè)spot測(cè)幾千個(gè)基因）
> head(brain@meta.data)
orig.ident nCount_Spatial nFeature_Spatial slice region
AAACAAGTATCTCCCA-1 anterior1 13069 4242 1 anterior
AAACACCAATAACTGC-1 anterior1 37448 7860 1 anterior
AAACAGAGCGACTCCT-1 anterior1 28475 6332 1 anterior
AAACAGCTTTCAGAAG-1 anterior1 39718 7957 1 anterior
AAACAGGGTCTATATT-1 anterior1 33392 7791 1 anterior
AAACATGGTGAGAGGA-1 anterior1 20955 6291 1 anterior
完成SCT和cluster后meta.data中會(huì)多出幾列：
brain@meta.data$seurat_clusters
brain@meta.data$SCT_snn_res.0.8
brain@meta.data$nFeature_SCT
brain@meta.data$nCount_SCT
但是我發(fā)現(xiàn)因?yàn)槲也]能下載他們pre-released版本，所以沒有需要的函數(shù)，然后在github上找解決方案：
https://github.com/search?q=seurat+v3.2&type=Issues不過沒什么用，所以我唯一能想到的就是改天再做
#github網(wǎng)站居然總是出現(xiàn)安全鏈接失敗。只能多試幾次，看什么時(shí)候人品回復(fù)正常
> devtools::install_github("satijalab/seurat", ref = "spatial")
Error: Failed to install 'Seurat' from GitHub:
schannel: failed to receive handshake, SSL/TLS connection failed
這里需要注意一個(gè)問題：
install_github()安裝包出錯(cuò): http://www.itdecent.cn/p/58e33b71b466
但是沒有解決這個(gè)問題，于是我嘗試了本地安裝，這樣可以繞開github安裝
[https://codeload.github.com/satijalab/seurat/legacy.tar.gz/spatial](https://codeload.github.com/satijalab/seurat/legacy.tar.gz/spatial) # 下載地址
install.packages("H:/singlecell/Seurat/satijalab-seurat-v3.1.1-302-g1cb8a3d.tar.gz", repos = NULL, type = "source")
#需要編譯，可能會(huì)報(bào)錯(cuò)，Rcpp系列的包該裝的都裝上
#成功
packageVersion("Seurat")
[1] ‘3.1.4.9902’#這個(gè)pre-release版本編號(hào)比較奇特
「R包」如何實(shí)現(xiàn)Seurat 2 和 Seurat3 在同一個(gè)環(huán)境下共存：https://www.baidu.com/link?url=aw0bEQi-VjJP2wC7m3jEAJwsOhqUoeHyf1M2wPr5p6iLTMQj1SeMepP7e6-wA3Y83Of_GVXvkqZ0cB-p7wXFSYOaTbpE-YjhFrGyXYSBNKe&wd=&eqid=bd40068700049ff0000000065e706341
下面這種方法是在沒有預(yù)注釋的情況下根據(jù)基因表達(dá)的情況，找出那些具有強(qiáng)烈空間定位傾向的基因：
#在FindSpatiallyVariables中
#實(shí)現(xiàn)的另一種方法是在沒有預(yù)注釋的情況下搜索顯示空間模式的特性。
#默認(rèn)的方法(method = 'markvariogram ')受到 Trendsceek,的啟發(fā)，
#后者將空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)建模為標(biāo)記點(diǎn)過程，并計(jì)算一個(gè)' variogram '，
#它識(shí)別其表達(dá)水平取決于其空間位置的基因。更具體地說，
#這個(gè)過程計(jì)算伽瑪(r)值，測(cè)量兩個(gè)點(diǎn)之間一定的“r”距離的相關(guān)性。
#默認(rèn)情況下，我們?cè)谶@些分析中使用的r值為‘5’
#注意這種計(jì)算會(huì)耗時(shí)較長
brain <- FindSpatiallyVariableFeatures(brain, assay = "SCT", features = VariableFeatures(brain)[1:1000],
selection.method = "markvariogram")
對(duì)于brain數(shù)據(jù)集我們可以提取我們感興趣的區(qū)域做進(jìn)一步分析
> head(brain@images$anterior1@coordinates)
tissue row col imagerow imagecol
AAACAAGTATCTCCCA-1 1 50 102 7475 8501
AAACACCAATAACTGC-1 1 59 19 8553 2788
AAACAGAGCGACTCCT-1 1 14 94 3164 7950
AAACAGCTTTCAGAAG-1 1 43 9 6637 2099
AAACAGGGTCTATATT-1 1 47 13 7116 2375
AAACATGGTGAGAGGA-1 1 62 0 8913 1480
同樣在空間轉(zhuǎn)錄組中也可以實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)集的整合，但是需要一個(gè)reference dataset: a reference scRNA-seq dataset of ~14,000 adult mouse cortical cell taxonomy from the Allen Institute, generated with the SMART-Seq2 protocol
# note that setting ncells=3000 normalizes the full dataset but learns noise models on 3k cells
# this speeds up SCTransform dramatically with no loss in performance
library(dplyr)
allen_reference <- SCTransform(allen_reference, ncells = 3000, verbose = FALSE) %>% RunPCA(verbose = FALSE) %>%
RunUMAP(dims = 1:30)
# After subsetting, we renormalize cortex 注意，reference和query data都要進(jìn)行歸一化和cluster操作
cortex <- SCTransform(cortex, assay = "Spatial", verbose = FALSE) %>% RunPCA(verbose = FALSE)
# the annotation is stored in the 'subclass' column of object metadata
DimPlot(allen_reference, group.by = "subclass", label = TRUE)
anchors <- FindTransferAnchors(reference = allen_reference, query = cortex, normalization.method = "SCT")
predictions.assay <- TransferData(anchorset = anchors, refdata = allen_reference$subclass, prediction.assay = TRUE,
weight.reduction = cortex[["pca"]])
cortex[["predictions"]] <- predictions.assay
獲得anchors以后我們就可以進(jìn)行數(shù)據(jù)的整合工作：
>anchors
An AnchorSet object containing 1236 anchors between 1 Seurat objects
This can be used as input to IntegrateData or TransferData.
上述步驟獲得了anchors并進(jìn)行了注釋的映射（TransferData)，這樣對(duì)于cortex的每一個(gè)spot我們都有了subclass注釋的預(yù)測(cè)性得分。
可以取出不同layer的細(xì)胞：
DefaultAssay(cortex) <- "predictions"
SpatialFeaturePlot(cortex, features = c("L2/3 IT", "L4"), pt.size.factor = 1.6, ncol = 2, crop = TRUE)
基于prediction的得分，同樣能找出那些有強(qiáng)烈空間定位傾向的細(xì)胞類型，不過和之前找variable features不同，這次用的是prediction score作為 marker而不是基因表達(dá)：
cortex <- FindSpatiallyVariableFeatures(cortex, assay = "predictions", selection.method = "markvariogram",
features = rownames(cortex), r.metric = 5, slot = "data")
top.clusters <- head(SpatiallyVariableFeatures(cortex), 4)
SpatialPlot(object = cortex, features = top.clusters, ncol = 2)
同一個(gè)Seurat對(duì)象還可以包含不同的slice，比如說，我們?nèi)×硪粎^(qū)域的brain數(shù)據(jù)集并歸一化：
brain2 <- LoadData("stxBrain", type = "posterior1")
brain2 <- SCTransform(brain2, assay = "Spatial", verbose = FALSE)
然后和原來的合并成一個(gè)Seurat對(duì)象：
brain.merge <- merge(brain, brain2)
接下來就可以對(duì)多個(gè)slice同時(shí)做PCA降維、聚類等分析了
DefaultAssay(brain.merge) <- "SCT"
VariableFeatures(brain.merge) <- c(VariableFeatures(brain), VariableFeatures(brain2))
brain.merge <- RunPCA(brain.merge, verbose = FALSE)
brain.merge <- FindNeighbors(brain.merge, dims = 1:30)
brain.merge <- FindClusters(brain.merge, verbose = FALSE)
brain.merge <- RunUMAP(brain.merge, dims = 1:30)
#其他的圖展示：
SpatialDimPlot(brain.merge)
SpatialFeaturePlot(brain.merge, features = c("Hpca", "Plp1"))
單細(xì)胞擬時(shí)分析
http://www.itdecent.cn/p/e94cff521ebc?tdsourcetag=s_pcqq_aiomsg
UMAP與t-NSE的區(qū)別
UMAP 與 t-SNE 均是非線性降維，多用于數(shù)據(jù)可視化
UMAP 結(jié)構(gòu)與t-SNE一致
UMAP 計(jì)算更快
UMAP 能更好地反映高緯結(jié)構(gòu)，比t-SNE有著更好的連續(xù)性
這種連續(xù)性反映到單細(xì)胞分析中就是能更好滴可視化細(xì)胞的分化狀態(tài)（UMAP better represents the multi-branched continuous trajectory of hematopoietic development）
參考：http://www.itdecent.cn/p/5aa1e2467339
We conclude that both techniques are similar in their visualisation capabilities, but UMAP has a clear advantage over t-SNE in runtime, making it highly plausible to employ UMAP as an alternative to t-SNE in mIF data analysis.
反卷積法推斷bulk RNA數(shù)據(jù)中的細(xì)胞組成
整體思路：細(xì)胞相互作用的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)支配免疫系統(tǒng)與腫瘤細(xì)胞之間的互動(dòng)，了解實(shí)體瘤的特定免疫細(xì)胞組成，對(duì)于預(yù)測(cè)患者對(duì)免疫療法有何反應(yīng)顯得至關(guān)重要。在這篇文章中，作者使用腫瘤單細(xì)胞RNA測(cè)序數(shù)據(jù)的適應(yīng)癥特異性和細(xì)胞類型特異性參考基因表達(dá)譜（RGEP），深入分析如何通過數(shù)學(xué)反卷積從bulk數(shù)據(jù)中得出實(shí)體瘤的細(xì)胞組成數(shù)據(jù)。證明了腫瘤衍生的RGEP對(duì)成功的去卷積至關(guān)重要，而來自外周血的RGEP則不足。我們區(qū)分了9種主要細(xì)胞類型以及3種T細(xì)胞亞型。使用源自腫瘤的RGEP，我們可以估計(jì)許多與腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的含量，治療相關(guān)的比例，以及完善的惡性細(xì)胞基因表達(dá)譜
http://www.itdecent.cn/p/74e8e4fa4643
從理論上講，如果可以為每個(gè)腫瘤相關(guān)細(xì)胞建立參考基因表達(dá)譜（RGEP），則可以從其整體基因表達(dá)譜推斷出實(shí)體瘤的免疫，腫瘤和基質(zhì)細(xì)胞含量。從數(shù)學(xué)上講，這類反推問題稱為反卷積
我們發(fā)現(xiàn)，來自不同患者的適應(yīng)癥特異性免疫細(xì)胞RNA-seq譜圖彼此足夠相似，可以為每種細(xì)胞類型定義一個(gè)共有譜圖，并且這些共有譜圖可以對(duì)腫瘤bulk譜圖進(jìn)行準(zhǔn)確的反卷積。
還可以參考：對(duì)混合細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)去卷積 （綜述）http://www.itdecent.cn/p/87caf98f3ca0
Gene expression distribution deconvolution in single-cell RNA sequencing：https://www.pnas.org/content/115/28/E6437
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組高級(jí)分析介紹
10xGenomics公司提供了一種將轉(zhuǎn)錄組與V(D)J聯(lián)合分析的平臺(tái)，我們可以對(duì)同一個(gè)細(xì)胞，同時(shí)獲得其轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和V(D)J數(shù)據(jù)，從而進(jìn)一步深入研究其免疫特征。
VDJ結(jié)果可以反映細(xì)胞亞群的相似性，如果兩個(gè)亞群的VDJ表型一致，那么兩個(gè)亞群的相似性越高。
單細(xì)胞RNA-seq、ATAC-seq分析工具集錦
https://github.com/seandavi/awesome-single-cell
Cell丨首個(gè)哺乳動(dòng)物單細(xì)胞染色質(zhì)調(diào)控圖譜——頡偉點(diǎn)評(píng)
http://www.360doc.com/content/18/0807/19/28251648_776437557.shtml
