Part6：DFI Immunological safety of DFI treatment

Para1:
為評(píng)估DFI治療的持續(xù)效應(yīng)與安全性，老年小鼠接受為期28天的DFI或?qū)φ誱RNA-LNPs處理，隨后停藥28天并進(jìn)行觀測(cè) (Supplementary Fig.6a)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組Luc相比，給藥期間外周血中TCR切除環(huán)水平升高，提示胸腺輸出功能增強(qiáng)；停藥后該指標(biāo)恢復(fù)至基線，表明DFI的免疫增強(qiáng)作用具有可逆性(Supplementary Fig. 6b,c)。同時(shí)，mRNA本身的短半衰期特性以及單次給藥后胸腺細(xì)胞Rag2表達(dá)的快速回落(Fig. 2f)，共同印證了該療法效果的瞬時(shí)與可控特征。

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• Supplementary Fig. 6A：實(shí)驗(yàn)流程圖：老年小鼠接受為期28天的DFI或Luc對(duì)照mRNA-LNP治療，隨后進(jìn)行28天洗脫期（停藥期）
• Supplementary Fig. 6B：治療第28天各組胸腺重量（每組n=5），組間比較
• Supplementary Fig. 6C：外周血中信號(hào)連接T細(xì)胞受體切除環(huán)（sjTREC）的定量分析，組間比較

Para2:
通過對(duì)脾臟進(jìn)行全組織空間轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，盡管停藥后胸腺輸出新T細(xì)胞的功能已開始下降，但在停止給藥28天后，脾臟內(nèi)的T細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞數(shù)量仍高于治療前基線水平(Supplementary Fig. 6d–g)，提示DFI的免疫重塑效應(yīng)具有一定持續(xù)性。然而，與之前注射DFI后立刻進(jìn)行疫苗接種不同，如果在停藥四周后再進(jìn)行疫苗接種，此前觀察到的有益效應(yīng)——包括疫苗特異性T細(xì)胞增加、耗竭樣細(xì)胞減少以及更健康的免疫細(xì)胞組成——均不再顯現(xiàn)(Supplementary Fig. 6h–k)。這表明，DFI所實(shí)現(xiàn)的免疫增強(qiáng)作用主要依賴于持續(xù)給藥，并在治療停止后逐漸消退。

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• Supplementary Fig. 6D-F：（D）脾臟結(jié)構(gòu)的STARmap投影圖；（E）標(biāo)志基因表達(dá)量熱圖；（F）已注釋免疫亞群的空間分布。
• Supplementary Fig. 6G：脾臟總T細(xì)胞及DC的數(shù)量，組間比較。
• Supplementary Fig. 6H：DFI治療后進(jìn)行OVA蛋白疫苗接種的實(shí)驗(yàn)流程圖。
• Supplementary Fig. 6I-K：SIINFEKL-H-2K?四聚體結(jié)合CD8? T細(xì)胞的占比、耗竭表型CD62L?PD-1hi CD8? T細(xì)胞的占比，以及初始、中樞記憶與效應(yīng)記憶CD8? T細(xì)胞亞群的占比，組間比較。