空間轉(zhuǎn)錄組揭秘兩種 EBV 相關(guān)淋巴瘤的微環(huán)境差異，為精準(zhǔn)治療提供新視角
Epstein–Barr 病毒（EBV）是首個被發(fā)現(xiàn)的人類腫瘤相關(guān)病毒，其感染引發(fā)的 T/NK 細(xì)胞淋巴增殖性疾病在亞洲人群中高發(fā)，其中結(jié)外 NK/T 細(xì)胞淋巴瘤（ENKTL）是最常見的亞型，而 EBV 陽性結(jié)內(nèi) T/NK 細(xì)胞淋巴瘤（EBV? nTNKL）則是新劃定的罕見亞型，二者均具有高度侵襲性，但臨床預(yù)后和治療反應(yīng)差異顯著。
二者雖同為 EBV 陽性且具有細(xì)胞毒性表型，卻有著截然不同的譜系起源——ENKTL 主要起源于 NK 細(xì)胞，EBV? nTNKL 則以 T 細(xì)胞起源為主，且目前 EBV? nTNKL 尚無標(biāo)準(zhǔn)化治療方案，治療策略多參照 ENKTL，療效有限。腫瘤微環(huán)境（TME）作為腫瘤細(xì)胞生存的核心生態(tài)系統(tǒng)，其細(xì)胞構(gòu)成、空間分布和細(xì)胞間通訊模式直接影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展、免疫逃逸及治療應(yīng)答，而慢性 EBV 感染正是通過重構(gòu)腫瘤微環(huán)境推動惡性轉(zhuǎn)化。
但目前科學(xué)界仍存在諸多未解答的核心科學(xué)問題：EBV? nTNKL 與 ENKTL 的腫瘤微環(huán)境在空間結(jié)構(gòu)、細(xì)胞組成上究竟存在哪些本質(zhì)差異？二者惡性細(xì)胞的增殖、代謝分子通路有何亞型特異性？細(xì)胞間的核心通訊信號通路是否不同？免疫微環(huán)境的活化狀態(tài)差異是否是導(dǎo)致二者臨床預(yù)后不同的關(guān)鍵原因？這些問題的解答，是實(shí)現(xiàn)兩種淋巴瘤亞型精準(zhǔn)分型、制定個體化治療策略的關(guān)鍵。
鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院的研究團(tuán)隊(duì)以空間轉(zhuǎn)錄組測序?yàn)楹诵募夹g(shù)，結(jié)合多重免疫熒光檢測、14 例 EBV? nTNKL（目前全球規(guī)模較大隊(duì)列）的回顧性臨床分析，首次系統(tǒng)且精準(zhǔn)地剖析了 ENKTL 和 EBV? nTNKL 的腫瘤微環(huán)境空間架構(gòu)、細(xì)胞異質(zhì)性、細(xì)胞間通訊特征及免疫景觀差異，相關(guān)研究發(fā)表于《Frontiers in Immunology》。紐科生物在其中完成了空間轉(zhuǎn)錄組測序和分析的工作。接下來，我們將圍繞研究結(jié)果部分，通過空間轉(zhuǎn)錄組的視角，逐一拆解研究團(tuán)隊(duì)對上述科學(xué)問題的解答。
一、空間轉(zhuǎn)錄組繪出微環(huán)境全景，細(xì)胞構(gòu)成呈現(xiàn)亞型特異性
為清晰解析兩種淋巴瘤的微環(huán)境空間架構(gòu)，研究團(tuán)隊(duì)選取 1 例 EBV? nTNKL、1 例 ENKTL 及 1 例慢性鼻 - 鼻竇炎（CRS）對照樣本，利用 10× Genomics Visium 平臺開展空間轉(zhuǎn)錄組測序，經(jīng)質(zhì)量控制后分別獲得 2683、2215 和 4446 個有效空間捕獲位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了腫瘤組織的高分辨率基因表達(dá)定位。
通過降維和無監(jiān)督聚類，研究在兩種淋巴瘤樣本中均鑒定出 7 個不同細(xì)胞聚類，并結(jié)合經(jīng)典標(biāo)記基因、拷貝數(shù)變異（CNV）譜完成細(xì)胞類型注釋，涵蓋 NK 細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、髓系細(xì)胞等多種基質(zhì)和免疫細(xì)胞。
核心亞型差異在此顯現(xiàn)：中性粒細(xì)胞聚類僅在 ENKTL 中存在，而 B 細(xì)胞聚類為 EBV? nTNKL 所特有。這種細(xì)胞構(gòu)成的特異性與二者組織起源密切相關(guān)——ENKTL 多發(fā)生于鼻腔，常伴隨慢性鼻炎，易招募中性粒細(xì)胞；EBV? nTNKL 原發(fā)于淋巴結(jié)，該部位本就富含 B 細(xì)胞。功能富集分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，ENKTL 的中性粒細(xì)胞聚類富集免疫系統(tǒng)激活通路，EBV? nTNKL 的 B 細(xì)胞聚類則富集細(xì)胞活化與增殖相關(guān)通路，提示不同細(xì)胞群在兩種淋巴瘤中發(fā)揮的功能存在本質(zhì)區(qū)別。
二、惡性細(xì)胞異質(zhì)性顯著，密度與轉(zhuǎn)錄特征各有不同
空間轉(zhuǎn)錄組通過量化注釋為惡性細(xì)胞的空間位點(diǎn)，直接反映腫瘤細(xì)胞的分布密度，結(jié)果顯示ENKTL 的惡性細(xì)胞密度顯著高于 EBV? nTNKL，這一結(jié)論在包含 10 例 ENKTL 和 10 例 EBV? nTNKL 的獨(dú)立驗(yàn)證隊(duì)列中，經(jīng)多重免疫熒光染色得到進(jìn)一步證實(shí)（ENKTL 以 EBER/GZMB/CD56 標(biāo)記惡性細(xì)胞，EBV? nTNKL 以 EBER/GZMB/CD3 標(biāo)記）。
在轉(zhuǎn)錄組特征上，與正常 CRS 組織相比，EBV? nTNKL 特異性上調(diào) AQP1、IGHA1、NR4A1 等 B 細(xì)胞和免疫調(diào)控相關(guān)基因，而 ENKTL 無此表達(dá)特征。KEGG 通路富集分析顯示，ENKTL 的惡性細(xì)胞中神經(jīng)活性配體 - 受體相互作用、細(xì)胞因子 - 細(xì)胞因子受體相互作用等通路激活；EBV? nTNKL 則以趨化因子信號通路、溶酶體通路異常調(diào)控為核心。
結(jié)合 TCR 重排分析和擬時間軌跡分析，研究進(jìn)一步明確：ENKTL 惡性細(xì)胞起源于 NK 細(xì)胞，其惡性進(jìn)展過程中依次激活 EBV 感染、脂肪酸延長、抗原加工提呈等通路；EBV? nTNKL 惡性細(xì)胞起源于 T 細(xì)胞，細(xì)胞周期調(diào)控、DNA 復(fù)制、花生四烯酸代謝等通路在其惡性轉(zhuǎn)化中發(fā)揮關(guān)鍵作用。兩種淋巴瘤的惡性細(xì)胞不僅起源不同，其增殖、代謝的分子通路也存在亞型特異性，為后續(xù)靶向治療提供了潛在靶點(diǎn)。
三、細(xì)胞間通訊通路迥異，信號調(diào)控分屬不同體系
腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞間的信號通訊是推動腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵，研究團(tuán)隊(duì)利用 CellChat 工具，基于空間轉(zhuǎn)錄組的基因表達(dá)和空間坐標(biāo)信息，解析了兩種淋巴瘤的細(xì)胞間通訊網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)二者的核心通訊模式和信號通路存在顯著差異。
從通訊強(qiáng)度和頻率來看，ENKTL 中最強(qiáng)的細(xì)胞間相互作用發(fā)生在惡性細(xì)胞與中性粒細(xì)胞之間，同時中性粒細(xì)胞與漿細(xì)胞也存在強(qiáng)烈通訊；EBV? nTNKL 的核心通訊則為惡性細(xì)胞與腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞之間，惡性細(xì)胞與上皮細(xì)胞的通訊也較為顯著。
在關(guān)鍵調(diào)控通路上，ENKTL 的惡性細(xì)胞 - 中性粒細(xì)胞相互作用主要由TGF-β/BMP 信號通路介導(dǎo)：BMP 信號主要在惡性 NK 細(xì)胞中激活，促進(jìn) NK 細(xì)胞增殖存活；TGF-β信號則在惡性 NK 細(xì)胞和上皮細(xì)胞中富集，介導(dǎo)中性粒細(xì)胞趨化并向免疫抑制性 N2 表型極化，最終形成免疫抑制微環(huán)境。
EBV? nTNKL 的惡性細(xì)胞 - 腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞通訊則以CXCL/CCL–GPCR 信號通路為核心：CXCL/CCL 趨化因子通過 G 蛋白偶聯(lián)受體激活下游 PI3K/AKT 和 MAPK 通路，調(diào)控細(xì)胞遷移、增殖和存活，放大腫瘤微環(huán)境中的炎癥反應(yīng)?？臻g定位結(jié)果更直觀顯示，ENKTL 的惡性 NK 細(xì)胞圍繞中性粒細(xì)胞分布，EBV? nTNKL 的惡性細(xì)胞則被腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞環(huán)繞，細(xì)胞的空間分布與信號通訊通路高度匹配。
四、免疫景觀差異明顯，EBV? nTNKL 呈免疫活化特征
腫瘤微環(huán)境的免疫狀態(tài)直接影響腫瘤的進(jìn)展和免疫治療效果，研究通過空間轉(zhuǎn)錄組量化腫瘤區(qū)域免疫相關(guān)基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ENKTL 的免疫相關(guān)基因表達(dá)顯著降低，呈現(xiàn)典型的“免疫荒漠”表型；而 EBV? nTNKL 的免疫相關(guān)基因表達(dá)水平更高，免疫微環(huán)境更活躍。
這一差異的成因主要與兩點(diǎn)相關(guān)：一是 ENKTL 基因組不穩(wěn)定性更高，而 EBV? nTNKL 基因組相對穩(wěn)定；二是 ENKTL 存在廣泛的啟動子高甲基化和獨(dú)特的 EBVⅡ型潛伏感染模式，導(dǎo)致免疫相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)，促進(jìn)病毒深度整合，進(jìn)而抑制免疫應(yīng)答。
獨(dú)立驗(yàn)證隊(duì)列的多重免疫熒光分析進(jìn)一步驗(yàn)證了免疫景觀的差異：與 ENKTL 相比，EBV? nTNKL 中 CD3? T 細(xì)胞、CD3?CD8?細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞的密度顯著更高，LMP1?腫瘤細(xì)胞密度更低；同時，EBV? nTNKL 的 PD-L1 表達(dá)水平更高，CD69?CD8?活化 T 細(xì)胞數(shù)量更多。而兩組的 CD3?CD4? T 細(xì)胞、調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞密度無顯著差異，提示 EBV? nTNKL 的抗腫瘤免疫應(yīng)答主要由 CD8?細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞介導(dǎo)，且免疫檢查點(diǎn)通路更活躍，為免疫檢查點(diǎn)抑制劑的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。
五、臨床特征與預(yù)后呼應(yīng)微環(huán)境差異，免疫治療顯潛在價值
結(jié)合 14 例 EBV? nTNKL 和 20 例 ENKTL 的回顧性臨床隊(duì)列分析，研究發(fā)現(xiàn)兩種淋巴瘤的臨床特征和預(yù)后差異，與空間轉(zhuǎn)錄組揭示的微環(huán)境特征高度呼應(yīng)。
EBV? nTNKL 主要累及中老年男性，71.4% 的患者伴高熱，85.7% 外周血 EBV DNA 升高，噬血細(xì)胞綜合征的發(fā)生率顯著高于 ENKTL，這與 EBV? nTNKL 免疫活化微環(huán)境中細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞過度活化密切相關(guān)。生存分析顯示，EBV? nTNKL 患者的中位總生存期（1074 天）和中位無進(jìn)展生存期（337 天）均顯著差于 ENKTL。
在治療方面，由于 EBV? nTNKL 暫無標(biāo)準(zhǔn)化治療方案，患者接受的化療方案存在高度異質(zhì)性，但部分患者接受免疫治療后展現(xiàn)出良好療效：2 例接受 CAR-T 治療的患者實(shí)現(xiàn)完全緩解，持續(xù)緩解時間分別達(dá) 1245 天和 320 天；2 例接受 PD-1 抑制劑單藥治療的患者，疾病控制時間分別為 552 天和 280 天。這一結(jié)果與 EBV? nTNKL 免疫活化、PD-L1 高表達(dá)的微環(huán)境特征相契合，提示免疫檢查點(diǎn)抑制劑、CAR-T 等免疫治療手段，可能成為該罕見亞型淋巴瘤的有效治療選擇。
本研究以空間轉(zhuǎn)錄組測序?yàn)楹诵募夹g(shù)，首次在空間維度上解析了 ENKTL 和 EBV? nTNKL 的腫瘤微環(huán)境異質(zhì)性，清晰揭示了二者在細(xì)胞構(gòu)成、惡性細(xì)胞特征、細(xì)胞間通訊、免疫景觀等方面的核心差異，同時結(jié)合臨床隊(duì)列證實(shí)了微環(huán)境特征與患者臨床預(yù)后、治療反應(yīng)的關(guān)聯(lián)性。
作為一種能保留組織空間結(jié)構(gòu)、實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)與細(xì)胞定位結(jié)合的技術(shù)，空間轉(zhuǎn)錄組測序?yàn)榻馕瞿[瘤微環(huán)境的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)提供了全新視角，也為淋巴瘤等腫瘤的亞型分型、精準(zhǔn)治療靶點(diǎn)篩選提供了重要技術(shù)支撐。對于 EBV? nTNKL 這一罕見淋巴瘤亞型，本研究的發(fā)現(xiàn)為其個體化治療策略的制定奠定了基礎(chǔ)，也為后續(xù)更大規(guī)模的多中心研究指明了方向。
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