筆記內(nèi)容：
拿到原始數(shù)據(jù)后，在做上游分析之前，需要了解和注意的：
- 16s rRNA是什么，測(cè)它有什么用
- 序列文件(raw sequence data)是怎么來的？
- raw sequence data的簡(jiǎn)要介紹
- checklist: 拿到raw sequence data后，需要check的事情
16s rRNA是什么，測(cè)它有什么用
細(xì)菌的核糖體RNA(rRNA)按照沉降系數(shù)分為5S, 16S, 23S三種。16s rRNA是微生物核糖體RNA的一個(gè)亞基，16s rDNA是編碼該亞基的基因，存在于所有細(xì)菌染色體基因中。測(cè)序是將16S rDNA擴(kuò)增出來，而不是研究RNA。
將翻譯16S rRNA的DNA擴(kuò)增出來測(cè)序，目的為識(shí)別樣本中有哪些原核生物物種(細(xì)菌/古菌)，研究物種多樣性。包括他們的相對(duì)豐度及物種構(gòu)成。
為什么可以根據(jù)16S rRNA來識(shí)別其物種？16S rRNA測(cè)序是測(cè)其上若干個(gè)可變區(qū)。這些可變區(qū)是species-specific的，可以根據(jù)這些可變區(qū)的序列特征識(shí)別出其物種。同時(shí)可變區(qū)中穿插著一些保守區(qū)。保守區(qū)則在不同物種之中變化不大，不能用于特異的識(shí)別其屬于哪一個(gè)物種。
灰色部分為可變區(qū)
raw sequence data是怎么來的？
Illumina二代測(cè)序的具體過程可以通過官方視頻了解，十分詳細(xì)。大概是:
- 采集樣品(如糞便，皮膚等), 提取微生物DNA
- 擴(kuò)增DNA：通過橋式擴(kuò)增，得到大量擴(kuò)增的DNA片段
- 測(cè)序：將帶熒光標(biāo)記的疊氮基團(tuán)結(jié)合到待測(cè)鏈上，得到各堿基對(duì)應(yīng)的特定熒光，以此得到測(cè)序結(jié)果。
- output: 測(cè)序得到n個(gè)reads，被output成fastq文件，根據(jù)primer和barcode來整理這些reads，得到各個(gè)樣本的R1和R2，再進(jìn)行后續(xù)分析。
參考wiki
參考illumina官網(wǎng)
官網(wǎng)視頻是youtube的，這里是一個(gè)B站的
另一個(gè)B站視頻
raw sequence data的簡(jiǎn)要介紹
raw sequence data的fastq格式文件，有固定的格式。參考https://en.wikipedia.org/wiki/FASTQ_format
列舉工作中常見的兩種雙端測(cè)序得到的raw seqence data：
-
未分樣本，按批次分文件的下機(jī)序列數(shù)據(jù):
批次a_R1.fastq.gz,批次a_R2.fastq.gz
批次b_R1.fastq.gz,批次b_R2.fastq.gz...
這樣的文件會(huì)附一個(gè)mapping file, 提供了各個(gè)樣本的barcode，F(xiàn)orwardPrimer及ReversePrimer，如下所示。有的只有一邊barcode，有的有雙barcode，下表為雙barcode的例子：
| sampleID | ForwardBarcode | ForwardPrimer | ReverseBarcode | ReversePrimer |
|---|---|---|---|---|
| sample1 | ATGCATCG | AGAGTTTGATCMTGGCTCAG | TAGGACCG | GCTGCCTCCCGTAGGAGT |
| sample2 | ATGCATCG | AGAGTTTGATCMTGGCTCAG | AAGCACTC | GCTGCCTCCCGTAGGAGT |
| ... | ... | ... | ... | ... |
示意圖
fastq格式:比方說這是a批次的R1和R2
-
按樣本分好各文件的序列數(shù)據(jù)：
sample1_R1.fastq.gz,sample1_R2.fastq.gz
sample2_R1.fastq.gz,sample2_R2.fastq.gz...
這種data不是很raw，是將1中的下機(jī)數(shù)據(jù)按照mapping file中樣本的信息分好，則得到這樣的文件。由于分好樣本了，基本不需要mapping file。但如果沒有去除adapter和primer，你需要找測(cè)序的人要adapter和primer，并且grep一下看看到底有沒有。
其fastq格式和上面的差不多。在不同的流程和軟件處理的過程中，其header會(huì)根據(jù)分析需求做出改變。
check list：拿到raw sequence data后，開始上游分析前
- 手頭的數(shù)據(jù)測(cè)的是16s的哪個(gè)區(qū)域？v1-v2?v3-v4?v4?，check對(duì)應(yīng)的primer. 將For和Rev的primer在R1和R2的序列中都grep一下。checkR1的file中是否存在ReversePrimer，R2的file中是否存在ForwardPrimer。
如果存在這種“互換”的情況，需要把它們換回來。并且記得將header中R1，R2的信息更新。
image.png
- raw data分好樣本了嗎？沒有的話需要根據(jù)barcode和primer來分樣本，跟測(cè)序合作者要mapping file
mapping file獲取之后，隨機(jī)抽取一些barcode和primer檢查，防止出現(xiàn)1中的問題。以及要檢查primer前的的序列是否真的是barcode。barcode前面是否還有其它前綴序列。
- 分好樣本的為XXR1.fastq, XXR2.fastq這樣的格式，不論是你自己分的還是raw data給到你就是這個(gè)，都要check primer和barcode是否還在上面，決定后面是否需要cutadapt。自己cutadapt之后也要check一下，以防cut錯(cuò)了。
- 在R1和R2中隨機(jī)抽取幾條blast看一下方向，是否與R1(+), R2(-)一致。也是防止R1和R2發(fā)生“互調(diào)”的問題。
- 遇到坑了再補(bǔ)充
