體外培養(yǎng)細(xì)胞的增殖特點(diǎn)

從培養(yǎng)時(shí)開始，培養(yǎng)物可從組織塊培養(yǎng)的外遷細(xì)胞中獲得，也可通過酶消化或機(jī)械方法分散組織獲得。不管采用何種方法獲得細(xì)胞，原代培養(yǎng)是一系列細(xì)胞選擇過程的第一步，其最終結(jié)果是產(chǎn)生一個(gè)相對(duì)均一的細(xì)胞系。細(xì)胞從組織塊培養(yǎng)中遷移出來的能力是選擇的條件之一；

而對(duì)分散的細(xì)胞來說，只有那些在離散后黏附到了培養(yǎng)器皿底面上生存下來的細(xì)胞， 或懸浮時(shí)能存活的細(xì)胞才可以成為原代培養(yǎng)的基礎(chǔ)。

如果原代培養(yǎng)能持續(xù)好幾個(gè)小時(shí)，那么就需要進(jìn)一步選擇。其中，有增殖能力細(xì)胞的數(shù)目逐漸增多；有些類型的細(xì)胞雖然存活了下來了，但并不增多；有的細(xì)胞在特定的培養(yǎng)條件下不能存活。因此，在培養(yǎng)中，各種類型細(xì)胞的相對(duì)比率都會(huì)發(fā)生變化，如果是單層培養(yǎng)物，這種變化將持續(xù)到支持物被完全鋪滿為止。

在細(xì)胞匯合后（即可利用的生長(zhǎng)空間均被占用，細(xì)胞彼此間緊密接觸），那些對(duì)生長(zhǎng)密度限制敏感的細(xì)胞就會(huì)停止分裂，而那些對(duì)生長(zhǎng)密度抑制不敏感的轉(zhuǎn)化細(xì)胞仍會(huì)繼續(xù)生長(zhǎng)，形成生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。因此，保持低細(xì)胞密度（如經(jīng)常進(jìn)行傳代培養(yǎng)）有助于維待培養(yǎng)物的正常表型，如小鼠成纖維細(xì)胞。

經(jīng)過第一次傳代培養(yǎng)后，原代培養(yǎng)物就被稱為一個(gè)細(xì)胞系，并可再增殖和傳代多次。在細(xì)胞的每次連續(xù)傳代培養(yǎng)中，群體中能快速增殖的細(xì)胞會(huì)逐漸占優(yōu)勢(shì)，而不能增殖或增殖緩慢的細(xì)胞會(huì)變得越來越少，這種現(xiàn)象在第一次傳代后最為明顯。增殖能力的差異加上對(duì)胰蛋白酶消化和傳代操作損傷耐受的差異，共同決定了每種細(xì)胞在群體中的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。

一些細(xì)胞系可形成連續(xù)細(xì)胞系。細(xì)胞系的待續(xù)生長(zhǎng)能力反映了細(xì)胞系的遺傳變異和選擇作用。遺傳變異常涉及p53基因的缺失和突變。正常p53基因能阻止細(xì)胞周期的進(jìn)程，如果DNA 發(fā)生突變或端粒酶表達(dá)，細(xì)胞就會(huì)獲得持續(xù)生長(zhǎng)的能力。人類成纖維細(xì)胞在培養(yǎng)過程中一直維持其整倍體性，不會(huì)轉(zhuǎn)化成連續(xù)細(xì)胞系。體外培養(yǎng)的小鼠成纖維細(xì)胞及一些人類或動(dòng)物腫瘤細(xì)胞， 一般難以維持其染色體的整倍體性，常產(chǎn)生連續(xù)細(xì)胞系。許多人類連續(xù)細(xì)胞系的共性就是出現(xiàn)亞四倍體的染色體數(shù)目。這種通過培養(yǎng)導(dǎo)致的連續(xù)細(xì)胞系變化稱為體外轉(zhuǎn)化，這種轉(zhuǎn)化能自發(fā)形成或被化學(xué)物質(zhì)和病毒所誘導(dǎo)。永生化是指細(xì)胞獲得了無限增殖的永久生存能力，而轉(zhuǎn)化則代表生長(zhǎng)特性的改變，如貼壁依賴性的喪失、接觸抑制和生長(zhǎng)密度抑制的喪失等，但這并不意味著就一定與腫瘤發(fā)生有關(guān)。連續(xù)細(xì)胞系通常都是非整倍體的，它的染色體數(shù)目一般都介于二倍體和四倍體之間。在培養(yǎng)的細(xì)胞群體中，通常還有相當(dāng)多的染色體數(shù)目和組成變異（異倍體），至今還不消楚這種連續(xù)細(xì)胞系是來自從組織塊向外生長(zhǎng)的少量細(xì)胞，還是由一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)化形成的。

許多正常細(xì)胞不能產(chǎn)生連續(xù)細(xì)胞系，最經(jīng)典的例子就是人的成纖維細(xì)胞，培養(yǎng)過程中始終保待染色體的整倍體性，并且在危機(jī)期（ 一般在50

代左右）將停止分裂，停止分裂后還可以再存活18 個(gè)月以上。人的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和雞的成纖維細(xì)胞也有類似的特點(diǎn)。另一方面，隨著培養(yǎng)技術(shù)的不斷提高，

表皮細(xì)胞的生命極限在不斷延長(zhǎng)， 并且能表現(xiàn)出連續(xù)的生長(zhǎng)能力。

就單個(gè)細(xì)胞而言，其增殖是通過周期性分裂實(shí)現(xiàn)的。細(xì)胞分裂的周期可分為4 個(gè)時(shí)期。M 期是有絲分裂期，染色質(zhì)濃縮成染色體，組成染色體的2 條染色單體分開，進(jìn)入2 個(gè)子細(xì)胞中。G1期是2 次細(xì)胞分裂的間隙，細(xì)胞要么進(jìn)入下一個(gè)細(xì)胞分裂周期，要么可逆地退出細(xì)胞周期，進(jìn)入靜止期G0。G1期存在多個(gè)控制點(diǎn)，可控制細(xì)胞周期的進(jìn)程，決定細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期或退出細(xì)胞周期而進(jìn)行分化。之后是S 期，即DNA 合成期， DNA 在這個(gè)時(shí)期復(fù)制。S 期之后是G2期，是細(xì)胞分裂前的準(zhǔn)備階段，G2期也存在控制點(diǎn)，可以控制DNA 的完整性，并保證細(xì)胞周期中DNA 修復(fù)的完成，若DNA 不能被修復(fù)，細(xì)胞則會(huì)發(fā)生凋亡。細(xì)胞凋亡是一個(gè)受控制的生理過程，可以清除群體中異常和受損的細(xì)胞。

就細(xì)胞群體而言，培養(yǎng)細(xì)胞的增殖，通常分為3 個(gè)時(shí)相。

延遲期(The Lag Phase)

：該期是指?jìng)鞔驮俳臃N后細(xì)胞數(shù)沒有增加的一段時(shí)間。這時(shí)期細(xì)胞適應(yīng)新的環(huán)境，它們要補(bǔ)充胰蛋白酶消化時(shí)所喪失的細(xì)胞表面蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)，細(xì)胞要貼附到培養(yǎng)器皿的表面，然后鋪展開來。在鋪展過程中，會(huì)重新出現(xiàn)細(xì)胞骨架。此外，酶的數(shù)量如DNA

聚合酶也增加。接著開始DNA 和結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的合成。某些特殊的細(xì)胞產(chǎn)物可能會(huì)消失。

對(duì)數(shù)期(the log phase) ：此期在延遲期之后，細(xì)胞數(shù)呈指數(shù)增加的時(shí)期， 井在達(dá)到匯合后以1 個(gè)或2

個(gè)群體倍增為止。對(duì)數(shù)期的長(zhǎng)度取決于接種密度、細(xì)胞的生長(zhǎng)速度及抑制細(xì)胞增殖的生長(zhǎng)密度。在此期間生長(zhǎng)分?jǐn)?shù)很高（通常90%～100%

），細(xì)胞處于最旺盛的增殖狀態(tài)。這是取樣的最佳時(shí)間，因?yàn)榧?xì)胞群體最均一，活性也最高。但此時(shí)相的細(xì)胞是隨機(jī)地處于細(xì)胞周期中的，因此出于某種需要，常常要將它們進(jìn)行同步化處理。

平臺(tái)期(the plateau phase)

：此期連接于對(duì)數(shù)期末，細(xì)胞成為匯合狀態(tài)，也就是可供生長(zhǎng)的表面均被細(xì)胞占據(jù)，它們與其周邊的細(xì)胞相互接觸。匯合之后，細(xì)胞的生長(zhǎng)速率降低，而且在某些情況下，

當(dāng)1 個(gè)或2 個(gè)群體倍增之后，細(xì)胞增殖幾乎徹底停止。至此階段，細(xì)胞培養(yǎng)便進(jìn)入平臺(tái)期（或稱靜止期， stationary

phase),生長(zhǎng)分?jǐn)?shù)為0%~10%

，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)減少；某些成纖維細(xì)胞相互沿一定方向排列，形成典型的平行排列方式。它們能占據(jù)的基質(zhì)表面積減少，與培養(yǎng)液的接觸也減少。但是與結(jié)構(gòu)蛋白相比，某些特殊蛋白的合成卻有增加，細(xì)胞表面的電荷也可能發(fā)生改變。

細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和生長(zhǎng)，因匯合或互相接觸而停止，這一性質(zhì)稱為接觸抑制(contact

inhibition)。此后，人們又認(rèn)識(shí)到正常細(xì)胞在匯合后生長(zhǎng)的停止并不是僅僅是由于接觸，還可能與細(xì)胞鋪展的減少及營(yíng)養(yǎng)不足有關(guān)，尤其是培養(yǎng)液中的生長(zhǎng)因子不足。于是，人們以“密度限制”(density

limitation) 代替接觸抑制，來描述這一性質(zhì)。

正常單層上皮和內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)在它們達(dá)到匯合后，便停止生長(zhǎng)并維持為單層。然而，對(duì)于大多數(shù)培養(yǎng)，只要定期更換培養(yǎng)液，即使匯合后也會(huì)繼續(xù)增殖（雖然生長(zhǎng)速率很低），這樣便形成了細(xì)胞的多層生長(zhǎng)。人胚胎肺和成體皮膚成纖維細(xì)胞雖然會(huì)表現(xiàn)出運(yùn)動(dòng)的接觸抑制，但只要有最適條件仍可繼續(xù)增殖，它們?cè)诩?xì)胞層之間的膠原可疊加起來，直至達(dá)6

層或更多層。然而，這些成纖維細(xì)胞仍保持著有序的平行列陣。也正因?yàn)槿绱?，?yán)格地說起來，“平臺(tái)期”和“靜止期”的提法并不十分準(zhǔn)確，使用時(shí)應(yīng)謹(jǐn)慎。

通常，

與相應(yīng)的正常細(xì)胞相比，自發(fā)轉(zhuǎn)化或者以病毒或化學(xué)致癌物誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞都能達(dá)到較高的細(xì)胞密度，常伴有較高的生長(zhǎng)分?jǐn)?shù)及細(xì)胞增殖密度限制性的喪失。這些培養(yǎng)物的平臺(tái)期是細(xì)胞增殖和細(xì)胞丟失之間的一種平衡。它們常常具有停泊非依賴性，也就是說它們能輕易地在懸浮條件下生長(zhǎng)。