如今我們在克隆時，不再只有傳統(tǒng)的限制酶克隆一種選擇，相反，還有許多其它的分子克隆技術(shù)，它們可以在特定的資源、時間、實驗需要下有效工作。自從1990s發(fā)現(xiàn)以來，Gateway克隆技術(shù)作為一種可以快速、高效將DNA序列轉(zhuǎn)移到載體上的克隆方法流行開來。有合適的entry和destination載體時，可以使用Gateway克隆技術(shù)將目的基因克隆到各種各樣的expression系統(tǒng)中。下面介紹Gateway克隆方法。
01
Gateway克隆技術(shù)原理
由Invitrogen開發(fā)的Gateway克隆方法是??噬菌體感染細(xì)菌時發(fā)生的整合和切割重組反應(yīng)的體外版本。在體內(nèi)，這些重組反應(yīng)被噬菌體和細(xì)菌上的重組位點attP和attB促進(jìn)。由于attP和attB位點間的重組，噬菌體整合到細(xì)菌基因組上，并形成兩個新的重組位點（attL-左-和attR-右-）。在特定的環(huán)境下，attL和attR位點也能重組，導(dǎo)致噬菌體從細(xì)菌染色體上切除，重新產(chǎn)生attP和attB位點。重組反應(yīng)交換位點實際上只發(fā)生在兩個位點核心的15bp同源區(qū)域，核心外圍的序列含重組酶的結(jié)合位點，所以也不可或缺。Gateway載體包含修飾了的att位點。
Gateway克隆技術(shù)依賴于下面描述的兩個反應(yīng)：
BP反應(yīng)發(fā)生在連接有插入片段的attB位點和donor載體（供載體）上的attP之間。該反應(yīng)受BP克隆酶混合物催化，生成entry克?。ㄈ腴T克?。?，其上含有attL位點連接的插入片段，而ccdB基因從donor載體上切除，兩側(cè)連接有attR位點。
BP克隆酶混合物：??噬菌體整合酶（Int）、大腸桿菌整合宿主因子（IHF）
LR反應(yīng)發(fā)生在entry克隆上的attL位點和destination載體（目標(biāo)載體）的attR位點之間。該反應(yīng)受LR克隆酶混合物催化，生成expression載體，其上含有attB位點連接的插入片段；并且一個含ccdB基因的DNA片段從destination載體上切除。
LR克隆酶混合物：??噬菌體整合酶（Int）、切除酶（Xis）、大腸桿菌整合宿主因子（IHF）
一旦完成了BP和/或LR克隆，下一步則是轉(zhuǎn)化、選擇陽性菌落。entry克隆和destination載體攜帶不同的抗生素標(biāo)記（上圖中用質(zhì)粒顏色加以區(qū)分），可通過使用抗生素選擇出expression克隆。不同于儲存含ccdB基因的載體時需要CcdB耐受菌株，進(jìn)行重組反應(yīng)時需要使用對CcdB敏感的大腸桿菌菌株，如DH5??、TOP10、Mach1。重組前，ccdB基因存在于donor載體和destination載體上，進(jìn)行BP或LR反應(yīng)過程中與目的基因進(jìn)行了交換。因為CcdB蛋白能抑制對CcdB敏感的大腸桿菌菌株生長繁殖，大多數(shù)可見的克隆應(yīng)該包含重組載體。
02
如何利用Gateway技術(shù)進(jìn)行克隆
為了更好的理解這個過程，下面舉一個使用Gateway克隆生成expression載體的例子：在哺乳動物細(xì)胞中使用慢病毒表達(dá)人類KRAS基因。
第一步：合成Entry克隆
有幾種不同的方法可以合成entry克隆——連接有attL位點的KRAS基因
方法A：BP克隆反應(yīng)，attB-PCR產(chǎn)物和含attP位點的質(zhì)粒發(fā)生重組生成entry克隆。這種情況下，使用PCR在KRAS編碼序列的兩側(cè)添加attB位點。如果選擇該策略，含有合適的蛋白表達(dá)元件（核糖體識別序列、起始密碼子、終止密碼子、閱讀框等）是重要的。
方法B：TOPO克隆，將插入片段的TOPO克隆插入到attL-entry-TOPO載體生成entry克隆。TOPO克隆添加短末端促進(jìn)其插入到含attL位點的entry克隆中。
方法C：限制克隆，酶切含酶切位點的插入片段和attL-entry載體，并連接生成entry克隆。這個片段被插入到attL-entry載體的多克隆位點（MCS）中。
第二步：合成Expression克隆
獲取expression克隆時，選擇適合特定實驗的destination載體是重要的。很多因素都會影響這個選擇，如宿主細(xì)胞、預(yù)期蛋白表達(dá)水平和實驗?zāi)康?。對于哺乳動物慢病毒表達(dá)，可使用載體如pLenti CMV Puro DEST（w118-1）或者強(qiáng)力霉素（doxycycline）誘導(dǎo)的pLIX 402。選擇的attR-destination載體將會和attL-entry克隆重組并產(chǎn)生expression克隆。
第三步：表達(dá)目的基因
通過酶切和測序鑒定expression克隆，確?？寺〕晒缶涂梢赞D(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染到該實驗使用的宿主細(xì)胞中。
03
Gateway克隆方法的優(yōu)點
兼容性和靈活性：一旦使用目的片段生成entry克隆，即可在一步重組反應(yīng)中移動該DNA片段到任何expression載體中。
耗時短：Gateway克隆系統(tǒng)可在一天內(nèi)生成expressin載體，而傳統(tǒng)的酶切連接克隆需要2天以上的時間。Gateway克隆也能在同一管中完成BP和LR克隆反應(yīng)，加速了attB-PCR產(chǎn)物直接克隆入destination載體的過程，其克隆過程簡單，不需要限制酶切、連接或gel純化步驟。
可進(jìn)行多片段克隆：可以使用Gateway克隆在一個管內(nèi)一次性在許多載體上插入多個DNA片段，可以特定的順序和方向克隆多達(dá)4個DNA片段到Gateway載體上，產(chǎn)生expression克隆。這得益于載體的設(shè)計，它們含有修飾了的attB、P、L和R位點，可特異性、有方向性地重組：attB1位點僅和attP1位點反應(yīng)，attB2僅和attP2反應(yīng)，attL1僅和attR1反應(yīng)，attL2僅和attR2反應(yīng)。
固定閱讀框：將DNA片段從一個Gateway載體移動到另一個上時，插入DNA片段仍在閱讀框內(nèi)。
高效：Gateway克隆中使用的正篩（抗生素）和負(fù)篩（CcdB）標(biāo)記可提高克隆效率（>99%）。
普遍性：所有類型的DNA片段都能被克隆：PCR產(chǎn)物、cDNA或者基因組DNA，并且可以用于各種各樣的生物體（從哺乳動物到大腸桿菌均可）。
04
Gateway克隆載體
