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寫在前面
從2016年10月底開(kāi)始，由克里克學(xué)院與康昱盛主辦的蛋白質(zhì)組學(xué)網(wǎng)絡(luò)大課堂正式開(kāi)班了，整個(gè)課程由21堂大課組成。作為蛋白質(zhì)組學(xué)純小白一枚，小編也打算借這個(gè)機(jī)會(huì)好好學(xué)習(xí)感受一下。繼第一講“蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法概述”以后，小編繼續(xù)整理了第二講“蛋白質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)樣品前處理”的聽(tīng)課筆記，今天是第四部分，分享給各位。

授課老師
這次課程的授課老師是來(lái)自復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院（IBS）的劉曉慧博士。我們知道，IBS的楊芃原老師實(shí)驗(yàn)室是中國(guó)蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域綜合實(shí)力最強(qiáng)的團(tuán)隊(duì)之一，劉老師就是在這里獲得了她的化學(xué)生物學(xué)博士學(xué)位，并在楊老師實(shí)驗(yàn)室工作十余年。作為實(shí)驗(yàn)室的骨干力量，她擁有非常豐富的蛋白質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)技能與經(jīng)驗(yàn)，并從事基于生物質(zhì)譜的蛋白質(zhì)和多肽定量方法的應(yīng)用和開(kāi)發(fā)，精通iTRAQ、MRM、MRM-HR、SWATH等相關(guān)技術(shù)，參與發(fā)表相關(guān)論文30余篇。劉老師在授課中詳細(xì)分享了她在蛋白質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)樣品前處理方面多年積累的珍貴經(jīng)驗(yàn)與心得，這樣的學(xué)習(xí)機(jī)會(huì)實(shí)屬難得！
（文中所有圖片均來(lái)自劉曉慧博士的講義，并獲得發(fā)表授權(quán)。）

之前小編通過(guò)三篇推文給大伙兒詳細(xì)分享了樣品前處理的各個(gè)步驟，今天我們來(lái)一起了解一下樣品前處理的最新方法及進(jìn)展，感興趣的小伙伴兒就請(qǐng)跟著小編一起來(lái)學(xué)習(xí)吧！

背景介紹
自從進(jìn)入了精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)時(shí)代，蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展也朝著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用的方向在不斷發(fā)展。

我們知道，在臨床應(yīng)用領(lǐng)域，常常需要用更多的樣品量來(lái)進(jìn)行研究分析，得到更多的結(jié)果。比如，用幾十上百例的蛋白質(zhì)組學(xué)樣品來(lái)進(jìn)行腫瘤分析。2014年Nature上發(fā)表過(guò)一篇文章，做了95例大腸癌的分析，通過(guò)label free結(jié)果對(duì)95例進(jìn)行分型。與之前的ATGC方法把大腸癌分成四個(gè)型比起來(lái)，蛋白質(zhì)組學(xué)的方法可以更精準(zhǔn)地分成五個(gè)型。這也是蛋白質(zhì)組學(xué)在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域一個(gè)很好的應(yīng)用實(shí)例。（Bing Zhang, Jing Wang, et al, Proteogenomic characterization of human colon and rectal cancer，nature,2014,3,382）

接下來(lái)我們分享兩種新方法，都可以實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單、可重復(fù)且自動(dòng)化的樣品前處理效果。

StageTips
第一種方法最早發(fā)表于2007年，到今年已經(jīng)成立了一家公司，將這種方法發(fā)展出來(lái)的裝置很好地商業(yè)化了。

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當(dāng)時(shí)，整套裝置還需要手工來(lái)組裝。不過(guò)組裝的方法也非常簡(jiǎn)單，根據(jù)上面的圖，分五步走：
第一步:準(zhǔn)備好一張3M的C18過(guò)濾膜，一個(gè)槍頭，一個(gè)平口的針頭和一個(gè)長(zhǎng)手柄；
第二步+第三步：在3M膜上取出一個(gè)小孔的膜，
第四步：將膜捅到EP管里面，用氣把它壓緊了，形成一個(gè)小的膜系統(tǒng)。
第五步：取出手柄和針頭，帶膜的槍頭就完成了。

C18過(guò)濾膜有脫鹽的效果，可以把蛋白質(zhì)或肽段截留在上面，通過(guò)水或BUFFER體系把鹽洗掉，之后再通過(guò)有機(jī)相把肽段或蛋白從C18膜上洗脫下來(lái)。

除了C18膜，還有很多種類型的膜，比如強(qiáng)陽(yáng)離子膜、陰離子膜等。大伙兒看看下面這個(gè)圖，感受一下這些膜的名字和成分。

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這里的柱狀圖是對(duì)比不同的膜處理后能鑒定到的肽段的數(shù)量，左圖是肽段水平的鑒定，右圖是蛋白水平的鑒定，差別都不太大（圖里的fr1，2，3是指餾分）。通過(guò)這個(gè)膜系統(tǒng)，可以進(jìn)行分級(jí)分離，也可以進(jìn)行脫鹽。

時(shí)間走到2009年，又出現(xiàn)了一種新的FASP（ filter-aided sample preparation）方法。之前的Stagetips只是為了進(jìn)行分級(jí)和富集，而FASP可進(jìn)行酶解（文獻(xiàn)見(jiàn)下圖）。

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到了2014年，這個(gè)團(tuán)隊(duì)又將StageTips和FASP方法結(jié)合起來(lái)，實(shí)現(xiàn)了所有的實(shí)驗(yàn)都在這個(gè)小管子里完成，樣品加入后先清洗，然后還原，清洗，烷基化，再清洗，最后酶解。酶解后的肽段一直留在下圖的“Reaction chamber”里，然后將肽段通過(guò)下方的膜脫鹽，洗脫，或者直接通過(guò)它進(jìn)行餾分的分離，收集樣品。

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四次重復(fù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，用這種裝置做下來(lái)，四次都能被重復(fù)的蛋白有92.9%，只有1.6%的蛋白是其中任意一次單獨(dú)鑒定到的，1.5%是其中兩次鑒定到的，4.0%是其中三次鑒定到的。如果我們考慮到這個(gè)實(shí)驗(yàn)一共鑒定到了9,667個(gè)蛋白（human proteins），在保證了較高的鑒定率的前提下，92.9%的四次重復(fù)率已經(jīng)相當(dāng)不錯(cuò)了！并且信號(hào)強(qiáng)度也比較一致。由于管子體積的限制，這套裝置很適合少量樣品的分析。

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該方法已經(jīng)商業(yè)化。2016年Cell Systems上發(fā)表了一篇用這套商業(yè)化的裝置做的血液樣品案例。如下圖，把血液樣品取出來(lái)后，直接加到裝備了膜系統(tǒng)的EP管里。通過(guò)優(yōu)化整個(gè)酶解系統(tǒng)，整個(gè)前處理過(guò)程2個(gè)小時(shí)之內(nèi)就能完成，其中裂解與還原烷基化是同時(shí)完成的。完成之后通過(guò)一個(gè)自動(dòng)化儀器，進(jìn)入質(zhì)譜，經(jīng)過(guò)0.5小時(shí)的質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)，以及15分鐘的結(jié)果分析，最后鑒定到了300多個(gè)常規(guī)的中高豐度蛋白（這個(gè)例子中沒(méi)有對(duì)血液中的高豐度蛋白進(jìn)行去除）。

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同樣的，文章里也對(duì)這次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了重復(fù)性評(píng)估，見(jiàn)下圖。

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從圖上看，鑒定的重復(fù)性特別好，尤其是49種FDA批準(zhǔn)的Biomarkers中，有41種的CV值都小于20%，說(shuō)明這些biomarkers可以通過(guò)該方法可重復(fù)地檢測(cè)到。這個(gè)方法被認(rèn)為很有希望發(fā)展為高通量樣品處理的方案。

（Tips: CV值，Coefficient of Variation，反映數(shù)據(jù)離散程度的絕對(duì)值。在進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析時(shí)，如果變異系數(shù)大于15%~20%，則要考慮該數(shù)據(jù)可能不正常，應(yīng)該剔除）

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以上是該公司的網(wǎng)址，有興趣的小伙伴可以登上去看看。目前最新的進(jìn)展是，重復(fù)性可以到0.99，樣品處理時(shí)間縮短到了1個(gè)小時(shí)，再加上20分鐘的質(zhì)譜分析，總體實(shí)驗(yàn)時(shí)間得到了很好地控制，實(shí)現(xiàn)了簡(jiǎn)單快速高效且可重復(fù)的要求！我們期待這個(gè)方法能早時(shí)用到臨床樣品的檢測(cè)上。

PCT壓力循環(huán)系統(tǒng)
第二種新方法叫PCT壓力循環(huán)系統(tǒng)。
剛才講到，可以通過(guò)壓力差來(lái)進(jìn)行樣品的破碎和蛋白的提取。另外，我們知道，在高壓條件下，很多反應(yīng)是會(huì)提高效率的，比如說(shuō)酶解、還原烷基化、樣品裂解等。下面這篇文章通過(guò)分析穿刺的樣品（量非常少，大概只有1立方毫米），放到PCT裝置里，通過(guò)樣品的處理，還原烷基化，酶解，酶解之后脫鹽，取出，直接進(jìn)行SWATH分析。

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我們來(lái)看下這種方法的結(jié)果評(píng)估。圖示上方的a 圖表明結(jié)果的SD（樣品標(biāo)準(zhǔn)差）都很小，說(shuō)明檢測(cè)結(jié)果很精確；b圖表明漏切的位點(diǎn)也很少.

圖示下方的a圖表明，可重復(fù)性CV值基本上都小于20%，只有其中兩次的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中差異大了一點(diǎn)。
了9對(duì)胃癌
文章里用這個(gè)方法分析的癌癥與癌旁組織，然后找到了一組蛋白成為癌癥的潛在標(biāo)志物。

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以上是兩種在蛋白質(zhì)臨床檢測(cè)方面非常有前途的方法，都實(shí)現(xiàn)了快速、高通量、高重現(xiàn)性，自動(dòng)化的處理，感興趣的童鞋可以重點(diǎn)關(guān)注一下。

最后，我們對(duì)整個(gè)第二講的內(nèi)容進(jìn)行一個(gè)小結(jié)，如下圖：

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通過(guò)以上的學(xué)習(xí)，你是不是對(duì)蛋白質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)的樣品前處理過(guò)程有了一個(gè)基本的概念呢？當(dāng)然，理論學(xué)習(xí)可以幫助我們邁出第一步，但這里面涉及著大量的實(shí)際操作，是需要親自動(dòng)手去做才會(huì)有更深的體會(huì)的。如果你在實(shí)際操作中遇到什么具體問(wèn)題，歡迎留言哦~

蛋白質(zhì)組學(xué)網(wǎng)絡(luò)大課堂的第二講“樣品前處理”小編就分享到這里，特別感謝本次課的授課老師劉曉慧博士對(duì)推文內(nèi)容的細(xì)心審核，也感謝所有陪小編一起學(xué)習(xí)進(jìn)步的小伙伴們！