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研究的背景
神經(jīng)元之間的信號(hào)傳遞方式主要依賴于神經(jīng)遞質(zhì)的分泌、傳遞和攝取。神經(jīng)遞質(zhì)是神經(jīng)元釋放的化學(xué)物質(zhì)，以特定的方式與特定的受體結(jié)合。神經(jīng)遞質(zhì)和受體之間的相互作用通常是短暫的，持續(xù)時(shí)間從幾毫秒到幾分鐘。然而，它的作用可能會(huì)在目標(biāo)細(xì)胞發(fā)生持續(xù)數(shù)小時(shí)或數(shù)天，這可能會(huì)對(duì)身體產(chǎn)生巨大的影響。
近年來，隨著社會(huì)壓力的加大，抑郁癥患者數(shù)量激增。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)，全球患有抑郁癥的人數(shù)已超過2.64億。抑郁癥已成為全世界殘疾的主要原因，也是全球疾病負(fù)擔(dān)的主要來源。研究表明，抑郁癥與大腦中去甲腎上腺素水平降低密切相關(guān)。
去甲腎上腺素是單胺類兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)合成的中樞物質(zhì)，在苯乙醇胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶(PMNT)的作用下，由多巴胺(DA)和腎上腺素(EP)的酶促反應(yīng)產(chǎn)生?？梢姡@三種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)相似，是通過酶促反應(yīng)相繼合成的。設(shè)計(jì)對(duì)去甲腎上腺素有特異性檢測(cè)的方法工具迫在眉睫。
傳統(tǒng)的神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)方法主要依靠電化學(xué)分析和質(zhì)譜分析，在體內(nèi)的原位檢測(cè)往往存在一定的局限性。在前期的研究中，作者初步發(fā)現(xiàn)去甲腎上腺素獨(dú)特的2-氨基乙醇部分與碳酸鹽發(fā)生級(jí)聯(lián)親核取代釋放熒光團(tuán)，從而實(shí)現(xiàn)去甲腎上腺素的特異性檢測(cè)。此外，它還成功地應(yīng)用于腦組織切片中去甲腎上腺素的雙重免疫熒光標(biāo)記。但是，該探針的水溶性和發(fā)射波長(zhǎng)較短，限制了其進(jìn)一步的應(yīng)用。
方案 1
在這項(xiàng)工作中，作者實(shí)現(xiàn)了去甲腎上腺素在水溶液中的紅色熒光檢測(cè)，使用花菁作為熒光團(tuán)來延長(zhǎng)其發(fā)射波長(zhǎng)，并引入磺酸鹽來大大改善其水溶性(方案 1)。隨后，該探針成功地標(biāo)記了PC12細(xì)胞中的去甲腎上腺素小泡，并對(duì)高鉀刺激下去甲腎上腺素的胞吐過程進(jìn)行了成像。首次實(shí)現(xiàn)了氟西汀(一種典型的抗抑郁藥)在體內(nèi)引起去甲腎上腺素升高的原位顯像。對(duì)抑郁癥藥物治療的研究和篩選具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。
(1)吸收和發(fā)射光譜
圖 1
探針在675和775 nm處的紫外吸收隨時(shí)間的推移而逐漸降低，而在550 nm處的紫外吸收則逐漸增加。相應(yīng)地，加入NE后，體系的熒光強(qiáng)度在640 nm處逐漸增強(qiáng)。
(2)活細(xì)胞內(nèi)源性去甲腎上腺素的顯像
圖 2
當(dāng)20 μM探針與Hela細(xì)胞和HepG-2細(xì)胞在37 °C培養(yǎng)40 min時(shí)，未觀察到熒光發(fā)射。研究表明，PC12細(xì)胞可以分泌富含去甲腎上腺素的囊泡，并具有胞吐作用。當(dāng)然，當(dāng)探針與PC12細(xì)胞在相似的條件下培養(yǎng)后，可以觀察到明顯的紅色熒光發(fā)射，并隨著時(shí)間的推移而增加(圖 2)。結(jié)果表明，該探針可以標(biāo)記囊泡中的去甲腎上腺素。
(3)去甲腎上腺素胞吐過程的成像
圖 3
據(jù)報(bào)道，高濃度鉀刺激細(xì)胞產(chǎn)生的動(dòng)作電位可引起電壓依賴性鈣離子通道去極化，從而打開鈣離子通道。在電化學(xué)勢(shì)的驅(qū)動(dòng)下，鈣離子從細(xì)胞外流入細(xì)胞；細(xì)胞質(zhì)中鈣濃度的增加觸發(fā)了囊泡與細(xì)胞膜的融合。因此，它刺激神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。本工作用高K+溶液刺激PC12細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)熒光點(diǎn)強(qiáng)度逐漸減弱，細(xì)胞內(nèi)含有探針標(biāo)記的去甲腎上腺素小泡。
在相同條件下，用PBS刺激細(xì)胞(不含鉀離子)。紅色通道中的熒光強(qiáng)度幾乎沒有變化(圖 3)。結(jié)果表明，K+濃度升高導(dǎo)致細(xì)胞胞吐，該探針實(shí)現(xiàn)了去甲腎上腺素信號(hào)通路的可視化。
(4)去甲腎上腺素在腦組織中的可視化
圖 4
如圖 4所示，涉及探針(B1，B2)和DBH-AF350(C1，C2)熒光發(fā)射的面積顯示出廣泛的重疊(E1，E2)，表明探針具有對(duì)非腎上腺素能神經(jīng)元的特異性標(biāo)記能力。
圖 5
此外，它仍然顯示了通過DBH和PNMT的雙重免疫標(biāo)記將去甲腎上腺素標(biāo)記為腎上腺素的探針(圖 5)。這種雙向檢測(cè)策略有力地證明了該探針可以在組織水平高效、特異地標(biāo)記去甲腎上腺素。
(5)活體熒光成像
圖 6
如圖 6所示，去甲腎上腺素組的紅色通道信號(hào)隨著時(shí)間的推移而增加，而對(duì)照組則沒有明顯變化。我們認(rèn)為該探針可作為體內(nèi)檢測(cè)NE的有效工具，在神經(jīng)遞質(zhì)和信號(hào)通路的定量分析中具有良好的臨床應(yīng)用前景。
(6)氟西汀去甲腎上腺素釋放顯像
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 圖7
與腹腔注射等量生理鹽水的大鼠相比，氟西汀治療的大鼠腦內(nèi)去甲腎上腺素水平明顯高于對(duì)照組(圖 7)。本研究結(jié)果為今后臨床抗抑郁藥物的篩選和療效評(píng)價(jià)提供了科學(xué)依據(jù)。至此，我們將通過特異性熒光探針生物成像，研究各種抗抑郁藥物在各種抑郁狀態(tài)下的干預(yù)和治療，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行深入研究，為開發(fā)有效的抗抑郁藥物提供有力的數(shù)據(jù)庫(kù)。
文獻(xiàn)原文：Zhou, N.; Huo, F.; Yue, Y.; Yin, C., Specific Fluorescent Probe Based on "Protect-Deprotect" To Visualize the Norepinephrine Signaling Pathway and Drug Intervention Tracers. J Am Chem Soc 2020, 142 (41), 17751-17755.
Doi：10.1021/jacs.0c08956
