酰胺鍵是一種廣泛存在的重要化學(xué)鍵,既是構(gòu)建蛋白質(zhì)和多肽的核心,也是多種藥物分子的活性中心。近年來,基于電化學(xué)的酰胺化反應(yīng)以高選擇性、環(huán)境友好等優(yōu)勢受到廣泛關(guān)注,然而,受限于反應(yīng)過程的復(fù)雜性以及缺乏適當(dāng)?shù)姆治黾夹g(shù),其原位監(jiān)測和機理研究卻鮮有報道。本研究通過在納升電噴霧噴針尖端集成金屬工作電極的方式構(gòu)建了一種新型耦合接口,實現(xiàn)了電化學(xué)與質(zhì)譜的在線聯(lián)用?；谠摷夹g(shù)原位監(jiān)測了以三苯基膦為縮合劑的芳伯胺酰胺化反應(yīng)過程,并實現(xiàn)了其中多種關(guān)鍵中間體,特別是一些短壽命自由基中間體的鑒定。該電化學(xué)-質(zhì)譜耦合接口具有延遲低、樣品耗量小、制備簡單等優(yōu)點,有望成為電有機合成反應(yīng)快速篩選和機理研究的重要工具。
關(guān)鍵詞：酰胺化反應(yīng);自由基中間體;原位質(zhì)譜;三苯基膦
酰胺鍵是構(gòu)筑各類生物活性分子的重要化學(xué)鍵,其廣泛存在于多肽、蛋白質(zhì)、臨床批準(zhǔn)的合成及天然藥物中,例如利多卡因、撲熱息痛、阿托伐他汀、嗎氯貝胺、卡托普利、乙酰唑胺、帕納替尼、甲氨蝶呤、曲美芐胺、青霉素、氯霉素類藥物。酰胺鍵具有獨特的化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì):1) 氮原子為sp2雜化,孤對電子所在的p軌道與羰基形成p-π共軛,因此,其C—N鍵具有部分雙鍵特征;2) 整個酰胺鍵呈平面幾何結(jié)構(gòu),與酰胺相連的基團之間可呈反式(trans)或順式(cis)構(gòu)象;3) 酰胺鍵中的羰基和氨基可分別作為氫鍵受體和氫鍵給體與靶蛋白形成復(fù)雜的氫鍵相互作用[1]。除作為重要的藥效團,酰胺鍵也常被用作各類化學(xué)偶聯(lián)的連接化學(xué)鍵,在生化傳感探針構(gòu)建中應(yīng)用廣泛[2]。因此,研究酰胺鍵的構(gòu)建方法與機理具有重要意義。
酰胺鍵的構(gòu)建除采用羧基(—COOH)與氨基(—NH2)在高溫下直接縮合外,更常見的策略是使用酰鹵、?；B氮化合物、酸酐、活性酯等活性前體化合物反應(yīng)生成[3]。其中,應(yīng)用最廣泛的是活性酯法,常見的縮合試劑(如磷正離子、脲正離子等)均是通過生成活性酯而最終形成酰胺鍵[4]。近年來,利用單電子轉(zhuǎn)移(single electron transfer, SET)的電化學(xué)氧化或電化學(xué)還原過程,通過產(chǎn)生自由基等活潑中間體促使合成反應(yīng)在溫和條件下平穩(wěn)進行,有機電化學(xué)合成已成為一種高效、高選擇性的綠色合成方式。例如,Nagahara等[5]利用三苯基膦存在情況下的電化學(xué)酰胺化反應(yīng)實現(xiàn)了多種藥物分子(如亮丙瑞林)的高選擇性合成,但受限于反應(yīng)的復(fù)雜性以及電化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的自由基活潑中間體的短壽命特性,對該電化學(xué)酰胺化反應(yīng)中自由基中間體形成的實驗證據(jù)及其超快轉(zhuǎn)化過程的解析仍具有挑戰(zhàn)性。
電化學(xué)反應(yīng)監(jiān)測常用的方法有紫外-可見光譜法[6]、瞬態(tài)吸收光譜法[7]、核磁共振波譜法[8-9]、電子順磁共振波譜法[10]等。雖然光譜法在反應(yīng)中間體監(jiān)測方面有較深入的發(fā)展,但在直接同時檢測多種反應(yīng)物、中間體、最終產(chǎn)物及副產(chǎn)物,特別是在瞬態(tài)中間體的形成與轉(zhuǎn)化動態(tài)過程等方面仍存在一定的局限性。質(zhì)譜法通過測量質(zhì)荷比能夠?qū)崿F(xiàn)多個物質(zhì)的同時免標(biāo)記、高靈敏測定,利用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)能夠獲取關(guān)于電生成物種,特別是自由基中間體的結(jié)構(gòu)信息。在化學(xué)反應(yīng)在線監(jiān)測方面,已報道多種基于解吸附電噴霧離子化質(zhì)譜(DESI-MS)[11-15]、萃取電噴霧離子化質(zhì)譜(EESI-MS)[16-20]、納升電噴霧質(zhì)譜(nESI-MS)[21-25]、超聲噴霧離子化質(zhì)譜(SSI-MS)[26-30]等裝置的接口。例如,Liu等[31]報道了使用納升解吸電噴霧電離(nano-DESI)裝置實現(xiàn)電化學(xué)與質(zhì)譜的在線聯(lián)用,但受限于nano-DESI較慢的流體輸運過程,其僅能實現(xiàn)電化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)物以及部分長壽命中間體的質(zhì)譜檢測。
本工作擬開發(fā)一種新的電化學(xué)-質(zhì)譜聯(lián)用接口,以實現(xiàn)電化學(xué)反應(yīng)中瞬態(tài)中間體的直接質(zhì)譜檢測,并研究這些活潑中間體的形成與轉(zhuǎn)化動態(tài)過程,希望為電化學(xué)反應(yīng)的機理研究及電有機合成反應(yīng)的快速篩選提供參考。
1 實驗部分
1.1 電化學(xué)-質(zhì)譜聯(lián)用接口的制備與表征
本研究開發(fā)的電化學(xué)-質(zhì)譜聯(lián)用接口示于圖1a。該集成化接口由1根噴鍍金屬薄層的玻璃毛細管構(gòu)成,其同時作為微型電化學(xué)反應(yīng)池和電噴霧電離的噴針。使用1臺配備有二氧化碳激光的微電極拉制儀拉制玻璃毛坯管(外徑1.00 mm,內(nèi)徑0.58 mm,長度10.0 cm),可得到所需開口直徑約2 μm的錐形空白噴針,示于圖1b。然后,使用電子束蒸發(fā)鍍膜儀完成毛細管外表面和針尖內(nèi)壁上金屬鉑的蒸鍍,即得鍍鉑噴針,其中,針尖內(nèi)金屬鍍層的元素表征結(jié)果示于圖1c。
1.2 電化學(xué)-質(zhì)譜聯(lián)用裝置
電化學(xué)-質(zhì)譜聯(lián)用裝置的接口針尖外表面的金屬鍍層與高壓電源連通以驅(qū)動電噴霧電離過程;針尖內(nèi)的金屬鍍層與針尖外表面的金屬鍍層也呈連通狀態(tài),且直接作為電化學(xué)反應(yīng)的工作電極。因此,通過施加高電壓可以同時驅(qū)動針尖上的電噴霧過程與電化學(xué)反應(yīng)過程,且毛細管針尖內(nèi)電化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的物質(zhì)能夠快速地轉(zhuǎn)移至噴霧液滴中,經(jīng)歷去溶劑過程而完成離子化,并最終被質(zhì)譜檢測。
1.3 質(zhì)譜條件
LTQ-Orbitrap質(zhì)譜儀正離子模式,質(zhì)量掃描范圍m/z?50～500;毛細管溫度275 ℃;噴霧電壓0.5～1.5 kV;最大離子注入時間50 ms(全掃描模式);二級質(zhì)譜分析所用的碰撞誘導(dǎo)解離(CID)參數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)化碰撞能量25%～35%。質(zhì)譜測試前,使用微量上樣器將約20 μL樣品灌注鍍鉑噴針,并置于質(zhì)譜入口前,其中,針尖前端與質(zhì)譜入口的距離約5 mm。使用正離子模式時,將質(zhì)譜儀內(nèi)置的正高壓電源通過導(dǎo)線與毛細管外表面的金屬鍍層相連,施加高電壓即可觸發(fā)針尖內(nèi)的電化學(xué)氧化反應(yīng)和電噴霧電離過程,進而完成針尖內(nèi)電化學(xué)氧化反應(yīng)的原位質(zhì)譜分析。
2 結(jié)果與討論
2.1 芐胺的電化學(xué)酰胺化反應(yīng)原位質(zhì)譜分析
電噴霧電離過程可被看作電化學(xué)反應(yīng)過程。為驗證鍍鉑噴針進行原位電化學(xué)反應(yīng)的能力,本研究考察了空白噴針和鍍鉑噴針分析三苯基膦溶液的情況,結(jié)果示于圖2。使用空白噴針進行電噴霧電離質(zhì)譜分析時,三苯基膦樣品產(chǎn)生m/z?263.098 5質(zhì)譜峰,示于圖2a。根據(jù)精確質(zhì)量數(shù)分析,其為三苯基膦的加氫峰(即[PPh3+H]+,分子式為[C18H15P+H]+,理論質(zhì)荷比為263.098 4,質(zhì)量偏差Δm=0.1 mu)。進一步對m/z?263.098 5進行CID分析,結(jié)果示于圖2b。根據(jù)三苯基膦的分子結(jié)構(gòu),并結(jié)合精確質(zhì)量數(shù)分析,對主要的碎片離子進行結(jié)構(gòu)確認。其中,m/z?262.090 0是母離子丟失1個氫原子(H)后形成的;m/z?185.049 2是母離子同時丟失1個苯基(C6H5)和1個H后形成的;而m/z?108.012 9則是母離子同時丟失2個C6H5和1個H后得到的。以上碎裂形式均與三苯基膦的分子結(jié)構(gòu)吻合。
使用鍍鉑噴針得到的三苯基膦溶液質(zhì)譜圖示于圖2c。與空白噴針相比,出現(xiàn)了m/z?262.090 5譜峰,根據(jù)精確質(zhì)量數(shù),推測其為三苯基膦的自由基陽離子(即[PPh3]·+,分子式為[C18H15P]·+,理論質(zhì)荷比為m/z?262.090 6,Δm=-0.1 mu)。該自由基陽離子的形成主要源自電噴霧電離過程中三苯基膦分子在噴針尖端內(nèi)金屬鉑層上的單電子轉(zhuǎn)移電化學(xué)氧化。使用串聯(lián)質(zhì)譜對該陽離子自由基結(jié)構(gòu)進行確認,結(jié)果示于2d。其中,m/z?261.082 5是母離子丟失1個H形成的;m/z?184.043 4是母離子同時丟失1個C6H5和1個H形成的;m/z?183.035 7可能是m/z?184.043 4繼續(xù)失去1個H后形成的;m/z?108.012 0是母離子丟失2個C6H5形成的。此外,還觀察到m/z?155.085 4譜峰,其可能為母離子丟失[C6H4P]碎片形成的;m/z?79.053 8可能為母離子丟失[C12H8P]碎片形成的?？梢钥闯?在相同的CID能量下,三苯基膦自由基產(chǎn)生了豐富的碎片離子,其碎裂模式與其加氫峰不同,主要體現(xiàn)在[C6H4P]、[C12H8P]等中性丟失過程。對三苯基膦自由基陽離子的成功檢測,表明了本研究的鍍鉑噴針具有監(jiān)測電化學(xué)反應(yīng)過程的能力,能夠?qū)崿F(xiàn)原位質(zhì)譜分析電氧化反應(yīng)產(chǎn)生的自由基中間體。
為進一步研究三苯基膦對羧基的活化過程,在相同實驗條件下,向已含有三苯基膦溶液的空白噴針和鍍鉑噴針中加入等摩爾質(zhì)量的對甲基苯甲酸,其結(jié)果示于圖3?？梢钥闯?加入對甲基苯甲酸后,空白噴針和鍍鉑噴針的譜圖中均出現(xiàn)了m/z?137譜峰,其為對甲基苯甲酸的加氫峰(即[4-methylbenzoic acid+H]+,分子式為[C8H8O2+H]+,理論質(zhì)荷比為m/z?137.059 7,Δm=0.4 mu)。與空白噴針相比,在鍍鉑噴針的質(zhì)譜圖上還觀察到m/z?397.135 9譜峰。根據(jù)精確質(zhì)量數(shù)分析,其為對甲基苯甲酸與三苯基膦進行電化學(xué)氧化反應(yīng)得到的活性酯中間體(即((4-methylbenzoyl)oxy)triphenylphosphonium,分子式為[C26H22O2P]+,理論質(zhì)荷比為m/z?397.135 2,Δm=0.7 mu)。對活性酯中間體進行串聯(lián)質(zhì)譜CID模式分析,結(jié)果示于圖3c。其中,m/z?279.093 1和119.049 3是該活性酯中間體酯鍵斷裂后形成的;m/z?263.098 2則是母離子P—O鍵斷裂后形成的,即三苯基膦的質(zhì)子化離子,其碎裂形式與其分子結(jié)構(gòu)吻合。
本實驗進一步研究電化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的活性酯中間體與氨基的反應(yīng),向三苯基膦-對甲基苯甲酸溶液中加入芐胺,原位質(zhì)譜分析結(jié)果示于圖4。由于芐胺的加入,質(zhì)譜圖中出現(xiàn)了m/z?108.081 0譜峰,為芐胺的加氫峰(即[benzylamine+H]+,分子式為[C7H9N+H]+,理論質(zhì)荷比為m/z?108.080 8,Δm=0.2 mu),示于圖4a。除芐胺信號,在使用鍍鉑噴針?biāo)玫馁|(zhì)譜圖中還觀察到酰胺化反應(yīng)產(chǎn)物的信號峰m/z?226.122 5(即[N-benzyl-4-methylbenzamide+H]+,分子式為[C15H15NO+H]+,理論質(zhì)荷比為m/z?226.122 6,Δm=-0.1 mu),示于圖4b,進一步的串聯(lián)質(zhì)譜分析結(jié)果示于圖4c,可以看出碎裂主要發(fā)生在酰胺鍵位置。其中,m/z?119.050 0和106.065 8是母離子酰胺鍵斷裂后產(chǎn)生的,m/z?91.054 8可能為m/z?119.050 0丟失1分子CO后形成的芐基碳正離子。需要指出的是,在使用空白噴針?biāo)玫娜交?對甲基苯甲酸-芐胺質(zhì)譜圖中未見酰胺化反應(yīng)產(chǎn)物的質(zhì)譜峰,表明電化學(xué)在該酰胺化反應(yīng)中具有重要作用。
根據(jù)上述實驗結(jié)果,推測三苯基膦電化學(xué)氧化介導(dǎo)的芐胺酰胺化反應(yīng)機理示于圖5。首先,三苯基膦分子在陽極上發(fā)生單電子氧化形成陽離子自由基([PPh3]·+);然后,其作為縮合劑與對甲基苯甲酸上的羧基反應(yīng),期間進一步在陽極上發(fā)生單電子、單質(zhì)子轉(zhuǎn)移的氧化反應(yīng),形成活性酯中間體;最后,活性酯中間體與芐胺的氨基反應(yīng)脫去1分子三苯基氧膦(Ph3P=O),形成相應(yīng)的酰胺化產(chǎn)物。通過原位監(jiān)測上述酰胺化反應(yīng)中關(guān)鍵中間體(如三苯基膦自由基、活性酯中間體等)的形成與轉(zhuǎn)化過程,為Nagahara等[5]提出的反應(yīng)機理提供了直接的實驗證據(jù)支持。
2.2 磺胺噻唑電化學(xué)酰胺化反應(yīng)原位質(zhì)譜分析
磺胺類藥物為人工合成的抗菌藥,臨床使用已超過50年,具有抗菌譜廣、性質(zhì)穩(wěn)定、使用簡便等優(yōu)點。其中,磺酰胺基對位上的游離氨基是抗菌活性的必需基團,若該游離氨基被酰胺化,則通常會失去抗菌活性。因此,制備用于特殊病灶的磺胺類藥物需要進行前藥修飾(如酰胺化修飾),以增加藥物穩(wěn)定性、延長藥物作用時間、提高藥物選擇性。以酞磺胺噻唑為例,游離氨基的酰胺化使其成為主要作用于腸道感染的抗菌藥。該化合物在腸道內(nèi)被水解為游離氨基,進而產(chǎn)生抑菌作用,常用于治療細菌痢疾[32]。用傳統(tǒng)方法合成酞磺胺噻唑需要將磺胺噻唑與苯酐進行?；磻?yīng),但這一過程往往需要較長的反應(yīng)時間,并涉及復(fù)雜的步驟。鑒于此,利用原位質(zhì)譜技術(shù)探究磺胺噻唑(ST)的電化學(xué)酰胺化反應(yīng)發(fā)生的可能性。
本實驗分別使用空白噴針和鍍鉑噴針分析磺胺噻唑-對甲基苯甲酸-三苯基膦的混合溶液,考察電化學(xué)酰胺化的反應(yīng)情況,結(jié)果示于圖6。由于磺胺噻唑的加入,譜圖中均出現(xiàn)了其加氫峰m/z?256.021 0(即[ST+H]+,分子式為[C9H9N3O2S2+H]+,理論質(zhì)荷比為m/z?256.020 9,Δm=0.1 mu)。使用鍍鉑噴針在m/z?374.063 1處觀察到新的譜峰,根據(jù)精確質(zhì)量數(shù),推測其是磺胺噻唑酰胺化產(chǎn)物的加氫峰(即[4-methyl-N-(4-(N-(thiazol-2-yl)sulfamoyl)phenyl)benzamide+H]+,分子式為[C17H15N3O3S2+H]+,理論質(zhì)荷比為m/z?374.062 8,Δm=0.3 mu),示于圖6b。串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)果驗證了該酰胺化產(chǎn)物的形成,示于圖6c。其中,m/z?358.031 8是母離子同時丟失1個CH3和1個H形成的;m/z?345.060 3是母離子同時丟失1個CH和1個O形成的;m/z?276.069 8是母離子失去[C3H2N2S]碎片后形成的;m/z?156.011 4是m/z?276.069 8碎片離子的酰胺鍵斷裂,進一步丟失[C8H7O]碎片和1個H形成的,其中[C8H7O]碎片對應(yīng)圖6c中m/z?119.049 0;m/z?219.056 8可能是母離子丟失[C6H5NO2S]碎片形成的;m/z?201.048 1可能是碎片離子m/z?219.056 8上的羰基發(fā)生酮式-烯醇式互變,進一步丟失1分子OH和1個H形成的。此外,在圖6c中還觀察到m/z?108.044 1譜峰,可能是碎片離子m/z?156.011 4失去1分子SO后產(chǎn)生的[C6H6NO]+,這與Du等[33]的報道一致。
根據(jù)上述實驗結(jié)果推測的電氧化三苯基膦介導(dǎo)的磺胺噻唑酰胺化反應(yīng)機理示于圖7。首先,電氧化三苯基膦形成的[PPh3]·+與對甲基苯甲酸上的羧基反應(yīng),同時在陽極上進一步發(fā)生單電子、單質(zhì)子轉(zhuǎn)移的氧化反應(yīng),形成活性酯中間體;隨后,活性酯中間體與磺胺噻唑的氨基反應(yīng),脫去1分子三苯基氧膦(Ph3P=O),最終形成相應(yīng)的酰胺化產(chǎn)物。利用鍍鉑噴針的原位電化學(xué)-質(zhì)譜監(jiān)測能力,成功驗證了電氧化三苯基膦介導(dǎo)的磺胺噻唑酰胺化反應(yīng)的可能性,為后續(xù)磺胺類藥物的酰胺化修飾提供了思路。
3 結(jié)論
本研究通過在納升電噴霧電離的噴針尖端集成金屬工作電極的方式,構(gòu)建了一種新型的電化學(xué)-質(zhì)譜聯(lián)用接口,實現(xiàn)了對電化學(xué)反應(yīng)的原位質(zhì)譜監(jiān)測。通過在線監(jiān)測一系列以三苯基膦為縮合劑的芳伯胺酰胺化反應(yīng)過程,該裝置接口的適用性得到了較好驗證,特別是對多種關(guān)鍵中間體(如三苯基膦陽離子自由基、活性酯中間體等)的質(zhì)譜鑒定,首次為Nagahara等提出的反應(yīng)機理提供了直接的實驗證據(jù)。此外,利用該原位質(zhì)譜方法成功驗證了磺胺噻唑酰胺化反應(yīng)的可能性,為磺胺類藥物的酰胺化修飾提供了思路。該電化學(xué)-質(zhì)譜耦合接口具有延遲低、樣品耗量小、制備簡單等優(yōu)點,有望成為電有機合成反應(yīng)快速篩選和機理研究的重要工具。
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