原理
氧基抗氧化能力（Oxygen Radical Absorbance Capacity, ORAC）是一種檢測各種樣品中生物分子抗氧化能力的經(jīng)典方法。ORAC方法對抗氧化性能的評價(jià)具有特異性好、靈敏度高、測定范圍廣，以及適合抗氧化活性的高通量篩選等優(yōu)點(diǎn)，在天然產(chǎn)物抗氧化提取物中得到越來越多的應(yīng)用，食品及功能食品企業(yè)普遍采用ORAC作為功能食品的重要評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。CheKine? 氧基抗氧化能力（ORAC）檢測試劑盒（熒光法）可檢測動(dòng)物或植物組織、細(xì)胞或細(xì)菌、血清（漿）等樣本，其原理是以熒光素鈉為熒光探針，偶氮類化合物AAPH作為過氧自由基來源，根據(jù)自由基破壞熒光探針，使熒光強(qiáng)度產(chǎn)生變化，熒光強(qiáng)度的變化大小反映自由基破壞的程度。在抗氧化劑存在時(shí)，它可以抑制由自由基引起的熒光變化，抑制程度反映了它對自由基的抗氧化能力。
自備耗材
·熒光酶標(biāo)儀（激發(fā)波長為485 nm，發(fā)射波長為525 nm）
·全黑96孔板
·低溫離心機(jī)、恒溫箱
·制冰機(jī)
·可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭
·去離子水、丙酮
·勻漿器（如果是組織樣本）
試劑準(zhǔn)備
1×Assay Buffer：使用前，Assay Buffer (2×)用去離子水稀釋成1×Assay Buffer，充分溶解待用。4℃保存。
1×ReagentⅠ：使用前，ReagentⅠ(100×)用1×Assay Buffer稀釋成1×Reagent I，充分溶解待用。用不完的ReagentⅠ(100×)在-20℃避光分裝保存1個(gè)月，避免反復(fù)凍融。不要儲(chǔ)存稀釋的1×ReagentⅠ溶液。
Working ReagentⅡ：臨用前配制19 mg/mL ReagentⅡ溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。例如，稱量19 mg ReagentⅡ加入1 mL 1×Assay Buffer，充分溶解待用。Working ReagentⅡ溶液不穩(wěn)定，應(yīng)立現(xiàn)配現(xiàn)用。
注意：ReagentⅠ和ReagentⅡ有一定的刺激性，建議在使用過程中做好個(gè)人防護(hù)。
Trolox Standard (5 mM)：使用前，用1×Assay Buffer稀釋成0.2 mM濃度，充分溶解待用。用不完的Trolox Standard（5 mM）-20℃避光分裝保存，避免反復(fù)凍融。
Standard設(shè)置：按下表所示，配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
序號(hào)0.2 mM標(biāo)準(zhǔn)品體積
（μL）
1×Assay Buffer體積
（μL）
標(biāo)準(zhǔn)品濃度
（μM）
Std.15015050
Std.24016040
Std.33017030
Std.42018020
Std.51019010
Std.651955
Std.72.5197.52.5
Std.802000
注意：每次實(shí)驗(yàn)都要做一次標(biāo)準(zhǔn)品檢測，制作標(biāo)曲；稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品溶液不穩(wěn)定，必須在4小時(shí)內(nèi)使用。
樣本制備
注意：樣本以新鮮為宜，若不能立刻檢測，應(yīng)儲(chǔ)存在-80℃保存。
1.動(dòng)物組織：稱取0.01-0.1 g樣本，加入適量的1×Assay Buffer，冰浴勻漿，10,000 g，4℃離心10 min，取上清液，置冰上待測。
2.植物組織：稱取0.01-0.1 g樣本，加入適量的1×Assay Buffer搗碎，冰浴超聲波破碎5 min（功率20%或200 W，超聲3 s，間隔7 s，重復(fù)30次），10,000 g，4℃離心10 min，取上清液，置冰上待測。
3.細(xì)胞或細(xì)菌：收集100-500萬細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，用冷PBS清洗細(xì)胞，離心后棄上清，加入適量的1×Assay Buffer，冰浴超聲波破碎細(xì)胞或細(xì)菌5 min（功率20%或200 W，超聲3 s，間隔7 s，重復(fù)30次），10,000 g，4℃離心10 min，取上清液，置冰上待測。
4.血漿或血清：用1×Assay Buffer稀釋100倍或更多進(jìn)行檢測。
5.液體樣本：10,000 g，4℃離心10 min，去除微粒，取上清液，置冰上待測。在進(jìn)行測定之前，根據(jù)需要稀釋上清液。
6.親脂性樣本：溶于100%丙酮中，用50%丙酮稀釋，在室溫下孵育1 h，10,000 g，4℃離心10 min，取上清液，置冰上待測。在進(jìn)行測定之前，根據(jù)需要稀釋上清液。
7.固體或高蛋白樣本：稱取固體樣本，加入去離子水（1:2，w/v），冰浴勻漿，10,000 g，4℃離心10 min，取水溶性部分的上清液。不溶物部分用去離子水洗滌，將此洗滌液與水溶性的上清液混合，合并的上清液可以用1×Assay Buffer稀釋并直接用于分析。而不溶物部分加入純丙酮（1:4, w/v）在室溫下混合30-60 min來進(jìn)一步提取。10,000 g，4℃離心10 min，取丙酮提取物的上清液用50%丙酮稀釋。通過將水溶性部分和不溶物部分的丙酮提取物的結(jié)果相結(jié)合，計(jì)算出總ORAC值。
注意：該試劑盒提取的樣本也可以適用于KTB1502的測定。
實(shí)驗(yàn)步驟
1.熒光酶標(biāo)儀預(yù)熱到37℃，激發(fā)波長為485 nm，發(fā)射波長為525 nm。
2.操作表（下述操作在全黑96孔板中操作）：
試劑空白孔（μL）標(biāo)準(zhǔn)孔（μL）測定孔（μL）
1×Assay Buffer2500
Standard0250
上清0025
1×ReagentⅠ150150150
混勻，37℃孵育30 min
Working ReagentⅡ252525
3.混勻，立即用熒光酶標(biāo)儀讀取熒光值，每5 min讀取1次，總共60 min。熒光酶標(biāo)儀的測定條件為激發(fā)波長為485 nm，發(fā)射波長為525 nm，儀器溫度保持在37℃。
注意：空白孔和標(biāo)準(zhǔn)孔只需做1-2次。實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)?？瞻卓椎淖罱K測定值應(yīng)小于初始值的10%。
結(jié)果計(jì)算
注意：我們?yōu)槟峁┑挠?jì)算公式，包括推導(dǎo)過程計(jì)算公式和簡潔計(jì)算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡潔計(jì)算公式為最終計(jì)算公式。
ORAC值根據(jù)熒光衰減曲線下凈面積(Area Under the Curve, AUC)=[AUC待測樣(抗氧化劑) - AUC(空白)]計(jì)算抗氧化劑的活性。
1. 從下面的等式計(jì)算AUC
AUC=1+RFU1/RFU0+RFU2/RFU0+RFU3/RFU0+……+RFU59/RFU0+RFU60/RFU0
RFU0=0 min的相對熒光值。
RFUx=x min的相對熒光值。（例如，RFU5是5 min時(shí)的相對熒光值）
2. 計(jì)算凈AUC：Net AUC=AUC(樣本)-AUC(空白)。
3. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為y軸，凈AUC為x軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
4. 將樣本的Net AUC帶入方程得到y(tǒng)值（μM），以微摩爾每升Trolox當(dāng)量（TE）或每克樣品的TE（μmol TE/ g或μmol TE/ L）表示ORAC值。
注意：若樣本進(jìn)一步稀釋，則需要再乘以進(jìn)一步稀釋的稀釋倍數(shù)n。
結(jié)果展示
典型標(biāo)準(zhǔn)曲線：
Figure 1. ORAC的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
實(shí)驗(yàn)實(shí)例：
取0.1 g動(dòng)物組織加入1 mL 1×Assay Buffer進(jìn)行勻漿研磨，取上清，稀釋50倍，之后按照測定步驟操作，用全黑96孔板測得:
樣本的AUC為6.715，空白的AUC為2.820，凈AUC=AUC(樣本)-AUC(空白)=6.715-2.820=3.895，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=4.9679x-0.916，Trolox濃度為18.43 μM，ORAC值(樣本)=18.43 μM×50(稀釋因子)=921.5 μM TE=921.5 μmol TE/L。
